本发明专利技术通过对艾滋病相关支原体（穿透支原体、发酵支原体和梨支原体）基因序列分析和比对，提供了适于同时检测这3种艾滋病相关支原体的三重荧光PCR检测的引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO.1-9所示，本发明专利技术还提供了对艾滋病相关支原体进行检测的方法和检测试剂盒。本发明专利技术的检测试剂盒及检测试剂具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的检测能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测艾滋病相关支原体的荧光定量PCR弓I物和探针及试剂盒。艾滋病相关支原体分别为穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)和梨支原体(Mycoplasma pirum)。
技术介绍
艾滋病相关支原体通常指穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)和梨支原体(Mycoplasma pirum)。这三种支原体在HIV感染及·AIDS的发展过程中起着辅助因子或者促进因子的作用，与艾滋病的发病具有显著的相关性，因此称为艾滋病相关支原体(参考文献Montagnier L, Blanchard A. Mycoplasmas asco-factors in infection due to the human immunodeficiency virus. Clin infectDis, 1993，17:5309.)。如果诊断出艾滋病患者带有穿透支原体、发酵支原体和梨支原体，在现有的治疗方案上进行针对性治疗，就能够减少感染机会，也就可以在一定程度上延长患者的生命。目前国内临床对于上述3种支原体的诊断技术十分有限，造成部分携带艾滋病相关支原体的患者不能及时有效诊断和治疗，加重了艾滋病病毒对机体免疫抑制，增大了机会感染其他病原，严重威胁艾滋病患者生命。及时有效诊断艾滋病感染者是否感染上述3种艾滋病相关支原体对于艾滋病的辅助治疗十分有效，但常规的病原体分离培养方法较难实施。这是因为艾滋病相关支原体的生长速度缓慢，分离培养困难，既增加了诊断成本，又延误了确诊时机，因此临床上不使用分离培养作为检测手段。目前，国内外尚无成熟的艾滋病相关支原体血清学检测试剂盒。尽管临床对艾滋病相关支原体在艾滋病发展进程中的作用及其临床检测技术越来越重视，但是目前已报道的PCR检测技术主要为普通PCR技术。国内对于艾滋病相关支原体检测主要依靠PCR方法(参考文献糜祖煌，赵季文，秦玲.淋病患者AIDS相关支原体的分离培养与核酸检测.中国人兽共患病杂志，2003，19 (3) :79-81.贾成梅，施素洁，羊海涛，等.从艾滋病患者和HIV感染者中分离2株支原体.中国人兽共患病杂志，2003, 19(6) :77-79. )。PCR检测灵敏度一般，且对于3种支原体分别进行检测和电泳判读结果耗时费力，极大的增加了临床检测工作量和检测成本，降低了检测效率。因此，急需建立一种快速、灵敏、特异的检测技术来提高临床对艾滋病相关支原体的检测能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种能同时检测3种检测艾滋病相关支原体的试剂盒和诊断试剂，以克服上述不足。本专利技术首先提供一种用于同时检测艾滋病相关支原体的三重荧光PCR引物组合，所述艾滋病相关支原体分别为穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)和梨支原体(Mycoplasma pirum)。本专利技术通过对NCBI数据库中报道的穿透支原体的ftsZ基因、发酵支原体的ftsZ基因和梨支原体的rpoB基因中保守区域使用Beacon Desinger7软件设计探针和引物。探针类型均为TaqMan探针，其中穿透支原体探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQl ；发酵支原体探针5’标记荧光基团HEX，3’标记淬灭基团BHQl ;梨支原体探针5’标记荧光基团R0X，3’标记淬灭基团BHQ2。进一步地，本专利技术提供的引物组合中，检测穿透支原体的引物序列为Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTA (SEQ ID NO. I)Mpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG (SEQ ID NO. 2)；检测发酵支原体的引物序列为Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATC (SEQ ID NO. 3)·Mfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC (SEQ ID NO. 4)；检测梨支原体的引物序列为Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATC (SEQ ID NO. 5)Mpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG (SEQ ID NO. 6)。本专利技术提供了与上述引物组合配合使用的荧光探针组合，其中与穿透支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)与发酵支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为Mfer-P:HEX-TTGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQ1 (SEQ ID NO. 8)与穿透支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为Mpi-P:R0X-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2 (SEQ ID NO. 9)。本专利技术还提供了上述引物组合和荧光探针组合在制备艾滋病相关支原体的检测试剂盒或诊断试剂中的应用。具体地，上述应用是将Platium quantitative PCR super Mix UDG12. 5 U I, 50mMMgCl2 2. Ou I ；Platium TaqO. 25 u I ；dNTP 混合溶液 l.Oul ；Mfer-F 和 Mfer-R 各 0. 8 y I ;Mfer-PO. 4 u I ;Mpen_F 和 Mpen-R 各 0. 5 y I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和 Mpi-F 各 0. 3 y I ;Mpi-PO. I u 1，无核酸酶水0. 35 ill ;待测样品DNA模板5. 0 构成25 u I的检测反应体系；上述引物和探针浓度均为25 u M0具体地，上述应用中，试剂盒的工作条件为95°C预变性3min，I个循环；95°C变性15s，57°C -60°C退火15s，40个循环；然后终止反应。优选地，试剂盒的工作条件中退火温度为59°C。本专利技术提供一种艾滋病相关支原体的诊断试剂，含有SEQ ID NO. 1-6所示的引物组合和SEQ ID NO. 7-9所示的突光探针组合；所述艾滋病相关支原体为穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)和梨支原体(Mycoplasmapirum)。本专利技术还提供一种艾滋病相关支原体的检测试剂盒，含有SEQ ID NO. 1-6所示的引物组合和SEQ ID NO. 7-9所示的突光探针组合；所述艾滋病相关支原体为穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)和梨支原体(Mycoplasmapirum)。本专利技术提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为无核酸酶水，所述阳性模板为艾滋病相关支原体穿透支原体、发酵支原体和梨支原体基因组DNA。进一步地，所述的试剂盒中，其25 ill的检测反应体系的具体配置为=Platiumquantitative PCR super Mix UDG12. 5 U I,50mM MgCl2 2.0 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于同时检测艾滋病相关支原体的三重荧光PCR引物组合，所述艾滋病相关支原体为穿透支原体（Mycoplasma？penetrans）、发酵支原体（Mycoplasma？fermentans）和梨支原体（Mycoplasma？pirum）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵飞，张建中，王艳冬，肖迪，张慧芳，何利华，孟凡亮，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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