一种梅花染色体的荧光原位杂交方法技术

本发明专利技术涉及一种梅花染色体的荧光原位杂交方法，以梅花中期染色体作为靶DNA，以玉米45SrDNA为探针，用缺刻平移法标记探针，将玉米45SrDNA探针清晰的定位在梅花染色体上。本发明专利技术在现有技术基础上，对共变性方法进行改进，采用探针变性、染色体和探针共变性两步来完成变性过程，大大提高杂交成功率。本发明专利技术确定了合适的变性温度和变性时间，杂交时间和洗脱方法，杂交特异性高，使得FISH技术很好的应用于梅花等小染色体植物的染色体检测，为梅花染色体深入研究，提供了新的途径和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及梅花染色体的荧光原位杂交方法。
技术介绍
突光原位杂交(Fluorescencein situ hybridization)是 20 世纪 80 年代末发展起来的一种重要原位杂交方法，以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的分子细胞遗传学技术。目前，它是构建细胞遗传图谱最直接的 方法之一，是研究DNA序列在染色体具体位置的最直接的方法，成为研究特定DNA序列与染色体区域相关联的有效手段。该技术在许多科学研究领域都得到非常广泛的应用，如DNA物理图诱、染色体图谱、细胞遗传图谱的构建、转基因的细胞学鉴定、外源染色体片段的检测、基因组结构的研究、物种间亲缘关系的鉴定。梅花(Prunus mume)是我国重要的木本花丼,对梅花染色体研究是进行基因定位、构建物理图谱的重要前提，为进一步选育优良品种、研究品种亲缘关系、并为梅品种国际登录和新品种保护提供分子水平品种鉴定技术。目前，关于梅花染色体的报道较少，仅限于利用压片法或涂片法进行镜检观察，根据染色体长短、大小以及长短臂进行核型分析。《梅花DNA指纹图谱的建立与研究》(明军，2002，北京林业大学)是通过AFLP银染反应体系对DNA进行分析，直观表现品种间的相似程度，但其多态性条带率与鉴别效率的相关性较低。由于梅花属于小染色体植物(野生种与栽培梅染色体数目及形态研究，包满珠，1995)，且染色体形态相似程度高，难以进行有效的核型分析。传统的核型分析方法有其自身的局限性，对于染色体小、形态相似的植物，其精确性有待提闻。因此，需要提闻杂交的特异性和效率，以获得良好的效果。不仅这样，在FISH实验过程中，由于固定方法或洗脱不完全，很容易导致非特异性杂交，产生假阳性；变性温度和时间也是一个重要的影响因素，时间过短、温度过低会造成杂交不完全，时间过长、温度过高会使染色体断裂丢失，造成杂交效率降低。因此，需要对FISH技术进行优化，使其很好地应用于梅花等小染色体植物。FISH技术在人类、动物以及少数植物中已成功运用，迄今为止，关于FISH技术在梅花中的应用未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测梅花染色体的荧光原位杂交方法以应用于梅花染色体核型分析。为达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案以梅花中期染色体作为靶DNA，以玉米45SrDNA为探针进行梅花染色体荧光原位杂交。具体地，包括以下步骤I)染色体玻片标本的制备与预处理；2)探针标记与探针变性；3)探针与染色体共变性；4)杂交与杂交后洗脱；5)信号检测。其中，步骤I)中所述染色体玻片标本的制备为以梅花茎尖为材料，采用去壁低渗火焰干燥法制备。其中，步骤I)中所述预处理为将所述染色体玻片标本干燥，RNaseA、胃蛋白酶K处理，乙醇脱水。其中，步骤2)中所述探针标记为将30-50ng/ μ I玉米45SrDNA质粒1_3份、DIG-Nick translation mix 或Biotin-Nick translation mix 4份和 ddH20 13-15份混合，10-15°C避光反应60-90min，加入EDTA I份，得探针标记混合液。·优选地，玉米45SrDNA质粒为3份，ddH20为13份。其中，步骤2)中所述探针变性为将所述探针标记混合液1-4份和10mg/ml鲑鱼精溶液4份按体积比混合，60-65°C烘烤；加入50%去离子甲酰胺10份、20 X SSC溶液2份、50%DS溶液4份，95°C避光变性lOmin，得变性探针。优选地，探针标记混合液为2份。其中，步骤3)中所述探针与染色体共变性为将变性后的探针加到染色体玻片标本上，共变性，变性温度85°C，变性时间2-4min。 优选地，变性时间为3min。其中，步骤4)中所述杂交为将所述共变性后的探针与色体玻片标本于37°C黑暗培养 18-24h。杂交液的成分按体积百含量为50%的去离子甲酰胺，20%的50%DS溶液，20%的10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液，10%的20 X SSC溶液。其中，步骤4)中所述杂交后洗脱为将杂交后的玻片依次放入2XSSC溶液，洗2X5min ;放入 2 X SSC 溶液，42°C恒温 IOmin ;放入 IXPBS 溶液，洗 5min。其中，步骤5)中所述信号检测为加2mg/ml DAPI荧光染液于玻片上，染色5_8min，进行检测。优选地，染色时间为5min。本专利技术的有益效果I)本专利技术在现有技术基础上，对共变性方法进行改进，采用探针变性、染色体和探针共变性两步来完成变性过程，大大提高杂交成功率。2)本专利技术清楚显示了梅花染色体，杂交特异性高，确定了合适的变性温度和变性时间，杂交时间和洗脱方法，使得FISH技术很好的应用于梅花等小染色体植物的染色体检测。3)本专利技术通过观察玉米45SrDNA在梅花染色体中的分布，区分同源及非同源染色体，辅助梅花核型分析，有利于其他基因在染色体上的物理定位，为梅花染色体深入研究，物理图谱的构建，梅花品种的分子鉴别及育种提供了新的途径和方法。附图说明图I为玉米45SrDNA在梅花‘龙游’中信号位点分布图像；图2为梅花‘龙游，中期分裂相图像；图3为梅花‘龙游’中期分裂相的荧光原位杂交效果图像；图4为梅花‘龙游’染色体核型图；图5为玉米45SrDNA在梅花‘小宫粉’中信号位点分布图像；图6为梅花‘小宫粉’中期分裂相图像；图7为梅花‘小宫粉’中期分裂相的荧光原位杂交效果图像；图8为梅花‘小宫粉’染色体核型图。具体实施方式·以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本专利技术所用试剂20XSSC 溶液(柠檬酸钠缓冲液):175. 3g NaCl,88. 2gNa2C6H507 · 2H20 和 1000mlddH20的混合液；10XPBS 溶液是指(磷酸缓冲液):80gNaCl、32. 3gNa2HP04 · 12Η20、4· 5gNaH2P04 ·2Η20和 1000ml ddH20 Ph=7. 4 的混合液。2 X SSC溶液ddH20与20 X SSC溶液体积比为9:1的混合液；4 X SSC溶液ddH20与20 X SSC溶液体积比为4:1的混合液；I X PBS溶液ddH20与10 X PBS溶液体积比为9:1的混合液；10mg/ml鲑鱼精溶液将IOmg鲑鱼精粉末溶于Iml蒸懼水，沸水溶解5min后分装-20°C保存；50%DS溶液0. 5g硫酸葡聚糖粉末溶于Iml水中，68°C水浴溶解3h后，分装_20°C保存；2 μ g/ml Anti-Dig-Rhodamine 溶液将 200 μ g Anti-Dig-Rhodamine 粉末溶于ImlddH2O中，4 °C保存。使用时，使用5%BSA溶液进行稀释，S卩I μ 1200 μ g/mlAnti-Dig-Rhodamine 溶于 99 μ 15%BSA 溶液；5%BSA溶液5g小牛血清蛋白粉末，溶于100ml4XSSC溶液；DAPI荧光染液2mgDAPI粉末溶于Iml ddH20,分装后4°C避光保存。O. lmg/ml胃蛋白酶K溶液将IOmg粉末溶于ImlddH2O配成原液，使用时将原液与ddH20按照1:99的配比进行稀释使用。O. lmg/ml RNaseA溶液将IO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梅花染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于以梅花中期染色体作为靶DNA，以玉米45SrDNA为探针进行梅花染色体荧光原位杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张启翔，陈晶鑫，杨冰洁，罗乐，杨炜茹，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：