本发明专利技术提供了一种引物特异荧光ＰＣＲ检测ＥＧＦＲ突变的试剂盒，特别涉及肿瘤组织以及肿瘤患者外周血清中ＥＧＦＲ基因突变的诊断。本试剂盒针对分子靶向抗癌药物疗效相关的特定突变位点，设计特异性的寡核苷酸引物序列和探针序列，对每一个待测样品，分别用野生型ＰＣＲ体系和突变型ＰＣＲ体系进行荧光ＰＣＲ检测，通过两次反应Ｃｔ值差值（ΔＣｔ）的大小，判断样品是否存在ＥＧＦＲ１９外显子和２１外显子的突变。本发明专利技术可对ＥＧＦＲ的特定位点是否存在突变进行检测，可用于分子靶向抗肿瘤新药的疗效预测和肿瘤患者临床个体化用药方案的指导。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别涉及以引物特异的实时定量荧光PCR技术检 测表皮生长因子受体(Epithelium Growth Factor Recptor， EGFR)常见突变的试剂盒。
技术介绍
由阿斯利康公司研制的吉非替尼(gefitinib，易瑞沙)EGFR酪氨酸激酶抑制剂 (EGFR-TKI)，是一种新型的肿瘤靶向治疗药物，有效地切断表皮生长因子受体向细胞内发出 信号，从而阻碍肿瘤的发生发展。美国、日本和中国学者近几年的研究表明，EGFR的体细胞 突变与NSCLC患者对吉非替尼的敏感性相关。对EGFR突变的肿瘤，Gefitinib的有效率高达 80%-90%，而对没有EGFR突变的肿瘤Gefitinib绝大部分没有效果。EGFR蛋白酪氨酸激酶 功能区由EGFR外显子18-24编码，迄今为止发现的EGFR突变主要发生在酪氨酸激酶域ATP 结合域附近，约90%的突变为外显子19的碱基缺失和21外显子在第858为密码子的碱基替 换突变。目前国内外主要采用基因测序技术检测肿瘤组织中EGFR突变，但是测序方法歩骤繁琐、 周期长、对操作人员要求高，难以在临床上广泛开展。更重要的是由于测序方法本身的限制 灵敏度不高，只能检测出突变基因占总基因15% 20%以上的突变，而肿瘤组织是一个异质 性的组织，EGFR突变又是一种杂合性的突变一即肿瘤细胞的含有EGFR基因的两条DNA中只 有一条发生突变，如果突变细胞在手术切除的肿瘤组织中的比例小于20%，则普通的测序方 法无法检出。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起來的。与传统 的(终点检测)PCR技术相比，实时定量检测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分 析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。扩增 阻碍突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS),是进行根据PCR扩增 引物与模板的匹配程度不同来区分单一位点突变型与野生型序列间差异的一种PCR方法。该 方法设计扩增引物的3'端的最后一个碱基与突变型碱基对应，相应野生型模板就不能有效扩 增。在这种定性的ARMS基础上，结合TaqMan定量技术，又发展了一种TaqMAMA方法(Taqman mismatch amplification mutation assay),该技术进一步将非特异扩增时引物与模板之间 的引物不匹配程度从3'端的最后一个碱基扩展到了倒数第二个，由此得以成功地辨别单一位 点突变。本专利技术主要就基于以上技术检测EGFR外显子中的常见突变。目前文献中用荧光PCR方法检测EGFR突变基本上都是采用Taqman-MGB探针技术，MGB 可以提高探针的Tm值，使探针设计更短，具有更好的淬灭效果，可以实现单点突变的检测。 但是， 一方面Taqman-MGB探针的设计对模板序列要求严格，难以保证在所有突变位置有合适 的探针序列；另一方面，利用Taqman探针的特异性来检测突变需要针对每一个突变类型设计 一对野生型和突变型探针，如EGFR外显子19的缺失突变据文献报道就有20种以上，如果要 检测其中10种突变就需要20个荧光探针，而T叫man-MGB探针价格昂贵，多重探针的使用会 大大增加检测成本。采用引物特异的荧光PCR方法则可以避免这两方面的问题，引物的设计 更加简单，而且合成成本低廉，对同一位置的不同突变类型可以采用多重引物一个探针进行 检测，既体现了荧光PCR方法简便，灵敏度高和特异性好的优点，有达到了降低检测费用的 目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测EGFR基因突变的实时荧光PCR试剂盒，可用于临床样品 中EGFR基因常见突变检测。为了完成上述任务，本专利技术的具体技术路线为(1) 针对EGFR19外显子、21外显子突变位点设计的分别能够与野生型和突变型模板的上 游或下游寡核苷酸引物，分别与EGFR 19外显子、21外显子野生型和突变型保守序列结合的下 游或上游寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。(2) 配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括19外显子野生型检测体系 (A)、 19外显子突变型检测体系(B)、 21外显子突变型检测体系(C)，每个检测体系中都包括耐热DNA聚合酶、dNTP、 UNG酶、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能 够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探 针、含有镁离子的缓冲液。(3) 从待测样本中提取DNA，加入前述的三个反应体系中，在荧光定量PCR以上进行PCR检测。(4) 确定样本在野生型检测体系、19外显子突变型检测体系、21外显子突变型检测体系 的Ct值，分别标记为CtA， CtB和CtC，如果CtB - CtA 〈阈值，则该标本EGFR外显子19有缺失 突变，如果CtC - CtA <阈值，则该标本EGFR外显子21有缺失突变，否则为野生型。本专利技术提供的EGFR基因突变检测试剂盒包括以下组分(1)野生型PCR反应液、19外显子 突变PCR反应液、21外显子突变PCR反应液、酶系、阴性质控品、野生型质控品、19突变型质控品、21突变型质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中酶系包含耐 热DNA聚合酶、dNTPs、 UNG酶和纯化水。根据本专利技术一个优选的实施方案，其中试剂盒的野生型PCR反应液由PCR缓冲液、19型 正向引物、19野生型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩 增的19型正向引物、19野生型反向引物和19型荧光探针的序列分别是 19型正向引物(EGFR19-F): 5'-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3' (SEQ ID N0:1) 19野生型反向引物(EGFR19-W-R): 5'-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3' (SEQ ID N0:2) 19型荧光探针(EGFR19-P) : 5， X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3， (SEQIDN0:3)， 其中X/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。根据本专利技术一个优选的实施方案，其中试剂盒的19外显子突变型PCR反应液由PCR缓冲 液、19型正向引物、19突变型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，19突变型反向引物 又包括19突变型1反向引物、19突变型2反向引物、19突变型3反向引物、19突变型4反 向引物、19突变型5反向引物、19突变型6反向引物、19突变型7反向引物，其特征在于 用于靶多核苷酸扩增的19型正向引物、19突变型反向引物和19型荧光探针的序列分别是 19型正向引物(EGFR19-F): 5' TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC 3' (SEQ ID N0:1) 19突变型1反向引物(EGFR19-Ml-R): 5'-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT -3' (SEQ ID N0:4)19突变型2反向引物(EGFR19-M2-R) 19突变型3反向引物(EGFR19-M3-R) 19突变型本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用引物特异的实时荧光聚合酶链反应技术检测ＥＧＦＲ突变的试剂盒，该试剂盒包括：野生型ＰＣＲ反应液、１９外显子突变ＰＣＲ反应液、２１外显子突变ＰＣＲ反应液、酶系、阴性质控品、野生型质控品、１９突变型质控品、２１突变型质控品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中１９外显子突变型ＰＣＲ反应液由ＰＣＲ缓冲液、１９型正向引物、１９突变型反向引物、１９型荧光探针和纯化水组成，１９突变型反向引物又包括１９突变型１反向引物、１９突变型２反向引物、１９突变型３反向引物、１９突变型４反向引物、１９突变型５反向引物、１９突变型６反向引物、１９突变型７反向引物，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的１９型正向引物、１９突变型反向引物的序列分别是： １９型正向引物：５′－ＴＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＣ－３′ １９突变型１反向引物：５′－ＴＧＧＣＴＴＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴ－３′ １９突变型２反向引物：５′－ＴＧＧＣＴＴＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＣＴＴＧＡＴ－３′ １９突变型３反向引物：５′－ＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＧＡＧＡＴＴ ＴＧＡＴ－３′ １９突变型４反向引物：５′－ＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴ－３′ １９突变型５反向引物：５′－ＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＡＴＴＣＣＴ－３′ １９突变型６反向引物：５′－ＧＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＧ ＡＡＣＣＴＴＧＡＴ－３′ １９突变型７反向引物：５′－ＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＣＴＴ－３′。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴荃，李明，程钢，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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