本发明专利技术提供了一种针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)中的甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)的化合物，该化合物为头孢噻呋盐酸盐，对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶具有显著的抑制活性，因此本发明专利技术提供的化合物能够用来制备针对结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的小分子抑制剂，有望成为抗Mtb感染的潜在药物。
Application of ceftithione hydrochloride in the treatment of Mycobacterium tuberculosis infection
The present invention provides a compound of methionine aminopeptidase (MetAP) in Mycobacterium tuberculosis (Mtb). The compound is ceftif hydrochloride and has significant inhibitory activity to methionine aminopeptidase in Mycobacterium tuberculosis. Therefore, the compound provided by the invention can be used to make it. Preparation of small inhibitors of methionine aminopeptidase for Mycobacterium tuberculosis is expected to become a potential drug against Mtb infection.
【技术实现步骤摘要】
头孢噻呋盐酸盐在抗结核分枝杆菌感染中的应用
本专利技术涉及药学的
，具体说是头孢噻呋盐酸盐在抗结核分枝杆菌感染中的应用。
技术介绍
结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是引起结核(TB)的致病性细菌，主要通过呼吸道传播，能够引起咳嗽、胸痛、咯血，呼吸困难等症状。健康人感染结核菌并不一定发病，只有在机体免疫力下降时才发病。世界卫生组织(WHO)统计表明，全世界每年发生结核病800～1000万，每年约有300万人死于结核病，是造成死亡人数最多的单一传染病。1993年WHO宣布“全球结核病紧急状态”，认为结核病已成为全世界重要的公共卫生问题。结核菌属分枝杆菌，于1882年由德国微生物学家RobertKoch发现。在显微镜下，结核菌为细长稍弯曲或直的杆菌。结核分枝杆菌是专性需氧菌，生长很缓慢，在固体培养基上，结核菌增代时间为18-20h，培养时间需8天以上至8周，在大部分培养基上菌落呈粗糙型。Mtb具有蜡质细胞壁，对干燥环境以及强酸强碱都具有极强的抵抗力，也不会被多种化学消毒剂渗透。结核菌实际上包括人型、牛型、鼠型和非洲型，为结核分枝杆菌复合群，其中人型、牛型和非洲型为致病菌。结核病是一个全球性的健康问题，每年都能引起100多万人的死亡，近年来，在结核病的控制方面，由于抗生素的滥用及其联合用药，导致多种耐药菌株的出现，尤其是Mtb和HIV的协同感染已被证实是致死性的。近年来，来自TB高发国家的移民、HIV携带者和社会边缘人群(如药物成瘾者和囚犯)中TB的发病率也呈上升趋势，这些现状都使我们控制结核分枝杆菌的面临严峻的挑战。所以，我们迫切的需要寻找结核分枝杆菌中的新型靶点，进而针对这些靶点开发新型的抗结核分枝的药物。结核分枝杆菌编码的蛋白酶具有100多种，这些蛋白酶的结核分枝杆菌的生长周期中发挥着重要的作用，然而，对于蛋白酶的研究却很少。在蛋白的翻译过程中，氨肽酶是选择性的除去新合成蛋白质和肽的N-末端的蛋白酶，是维持许多病原体微生物生长必不可少的蛋白酶。甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)能够除去每个活细胞中新合成蛋白质中的甲硫氨酸，而抑制这个功能对细胞生存是有害的。故MetAP是一个非常好的开发抗结核药物的靶点。因此，MetAP也成为一个关键的抗结核分枝杆菌的药物靶标，所以针对MetAP进行抑制剂筛选对结核分枝杆菌感染的相关的药物研发具有很大的意义。头孢噻呋盐酸盐，英文名是CeftiofurHCl，为动物专用的第三代头孢菌素，主要用于治疗敏感菌所致的猪、牛、马、犬及一日龄雏鸡感染性疾病。但迄今为止，头孢噻呋盐酸盐在抗结核分枝杆菌感染中的应用未见报道。
技术实现思路
针对相关技术中的问题，本专利技术提供头孢噻呋盐酸盐在抗结核分枝杆菌感染中的应用。本专利技术还提供了针对结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的抑制剂。本专利技术所涉及头孢噻呋盐酸盐CAS号为103980-44-5，购买于Selleck.cn公司。在分子水平上，通过设立阴性对照，发现头孢噻呋盐酸盐对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶有很好的抑制活性，因此该化合物有望作为抑制结核分枝杆菌感染的潜在药物。本专利技术提供一种用于预防或治疗结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)感染的药物，其活性成分为头孢噻呋盐酸盐，该药物包含上述含有头孢噻呋盐酸盐以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术的针对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)的抑制剂，这种抑制剂为头孢噻呋盐酸盐。头孢噻呋盐酸盐对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶活性具有显著的抑制效果。附图说明图1是头孢噻呋盐酸盐对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶的抑制作用示意图图2是头孢噻呋盐酸盐对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶的IC50的测定示意图具体实施方式：为了更好地说明本专利技术，在下面将详述本专利技术的具体实施方式。1.结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)的表达与纯化根据文献(LuJP,YeQZ.ExpressionandcharacterizationofMycobacteriumtuberculosismethionineaminopeptidasetype1a.[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2010,20(9):2776-2779.)(1)将含有编码MetAP基因的pET28a载体转化EscherichiacoliBL21(DE3)的菌株，并用LB平板培养基(含50mg/L卡那霉素)筛选阳性克隆。(2)在平板上挑取阳性克隆，37℃培养过夜后转入0.8L的LB培养基(含50mg/L卡那霉素)，当其在600nm波长处的吸光值(即，OD600)达到0.6时，加入0.1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)在20℃培养18小时。(3)用5000rpm离心10min收集细胞后高压破菌；破菌液用10000rpm离心30min后收集上清液。(4)将上清液加入破菌buffer(50mMHepes,0.5MNaCl,pH8.0)预平衡的Ni-NTA亲和层析柱中，使目的蛋白与Ni充分结合，使目的蛋白充分富集。(5)用含有20mM咪唑的破菌buffer洗掉未结合的杂蛋白，考马斯亮蓝G250检测流出液不变蓝时，说明大部分杂蛋白被冲洗干净。用含150mM咪唑的破菌buffer洗脱MetAP，然后用10kD的浓缩管浓缩换液，用阴离子交换层析进行纯化来获得具有电荷均一性的目的蛋白。2.MetAP的活性测定采用纯度大于95％的Met-pNA作为底物；使用酶标仪进行测定，测定光吸收波长为405nm。蛋白缓冲液组分为25mMHepes,150mMNaCl，10％甘油，pH＝8.0，40μMNi2+，用缓冲液配置MetAP(终浓度4μM)，加入溶解于DMSO(二甲基亚砜)的化合物(终浓度为20μM),室温放置5min,迅速加入底物Met-pNA，底物浓度为200μM。每20s记录一次吸光值读数，共测定1200s。654rpm震荡10s，检测吸光度值。阴性对照不加备选样品，其它实验条件均相同。以时间为X轴，吸光度值为Y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据吸光值以及反应时间，采用GraphPadPrism5软件分析酶促反应的速率。设定V0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，Vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的抑制率Ir(InhibitionRate,Ir)(1-Vi/V0)。对化合物进行复筛，排除操作失误造成假阳性的可能。3.化合物头孢噻呋盐酸盐IC50的测定在测定IC50时，首先配置实验所需的蛋白MetAP,终浓度为4μM，再用95％的DMSO配置底物Met-pNA,使其终浓度为200μM。根据初筛结果粗略的设定10个抑制剂浓度(一般是通过梯度稀释得到)，头孢噻呋盐酸盐的浓度分别是100μM、50μM、25本文档来自技高网...
【技术保护点】
头孢噻呋盐酸盐在治疗结核分枝杆菌感染中的应用。
【技术特征摘要】
1.头孢噻呋盐酸盐在治疗结核分枝杆菌感染中的应用。2.头孢噻呋盐酸盐是结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的小分子抑制剂。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，头孢噻呋盐酸盐的结构式为：4.一种治疗结核分枝杆菌感染的药物，其特征在于它包含权利要求书1或2所述的头孢噻呋盐酸盐以及...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨海涛，李瑞，张晓玲，刘祥，胡灿，张晴晴，
申请(专利权)人：天津国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：天津,12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。