依布硒在抗人冠状病毒NL63感染中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种针对人冠状病毒NL63(Human Coronavirus NL63，HCoV

【技术实现步骤摘要】
依布硒在抗人冠状病毒NL63感染中的应用


[0001]本专利技术涉及药学的
，具体说是依布硒在抗人冠状病毒NL63感染中的应用。

技术介绍

[0002]2003年爆发的SARS疫情对人类生命健康造成了严重危害，几乎在相同时间，一种新型的冠状病毒HCoV
‑
NL63在世界多个国家被发现。幼龄儿童、免疫功能低下的人和老人为HCoV
‑
NL63的易感人群，感染后会出现诸如发烧、咳嗽、喉咙痛和鼻炎等上呼吸道疾病，严重时可引起细支气管炎、细支气管内膜炎等下呼吸道疾病，甚至危及生命，最快可在病发5天内令患者死亡。HCoV
‑
NL63已成为引发人类呼吸道感染的重要病原体之一，但目前仍没有针对此病毒的特效药物，因此对其进行抑制剂的研究，找到相应的药物迫在眉睫。
[0003]人冠状病毒NL63基因组可以编码一种半胱氨酸蛋白酶
‑
木瓜样蛋白酶2(HCoV
‑
NL63 PL
pro
2)，可以切割冠状病毒ORF1a和ORF1b编码的复制酶复合物两个前体多聚蛋白pp1a和pp1ab，释放两个个非结构蛋白nsp2～3，调节宿主功能从而促进病毒感染，在病毒的转录、复制过程中起重要作用。此外，HCoV
‑
NL63 PL
pro
2还具有促进病毒复制的去泛素化(DUB)、去ISG化和拮抗干扰素作用，使病毒逃避宿主免疫应答。因此，木瓜样蛋白酶2成为一个关键的抗人冠状病毒NL63的药物靶标，所以针对木瓜样蛋白酶2进行抑制剂筛选对人冠状病毒NL63感染的相关的药物研发具有重大意义。
[0004]依布硒，英文名为Ebselen，是一种新型抗炎药，在体外表现出极好的抗炎活性，且不同于常规非甾体抗炎药，没有胃肠道刺激作用，目前在治疗类风湿性关节炎和骨关节炎等方面具有一定效果。目前，暂无依布硒具有抗人冠状病毒NL63感染方面的报导。

技术实现思路

[0005]针对相关技术中的问题，本专利技术提供依布硒在抗人冠状病毒NL63感染中的应用。
[0006]本专利技术还提供了针对人冠状病毒NL63中木瓜样蛋白酶2的抑制剂。
[0007]本专利技术所涉及依布硒CAS号为60940
‑
34
‑
3，购买于上海麦克林生化科技有限公司。在分子水平上，通过设立阴性对照，发现依布硒对人冠状病毒NL63中的木瓜样蛋白酶2有很好的抑制活性，因此该化合物有望作为抑制人冠状病毒NL63感染的潜在药物。
[0008]本专利技术提供一种用于预防或治疗人冠状病毒NL63感染的药物，其活性成分为依布硒，该药物包含上述含有依布硒以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径为口服。
[0009]本专利技术具有的优点和积极效果是：
[0010]本专利技术的针对人冠状病毒中的木瓜样蛋白酶2的抑制剂，这种抑制剂为依布硒。依布硒对人冠状病毒NL63中的木瓜样蛋白酶2活性具有显著的抑制效果。
附图说明
[0011]图1是依布硒对人冠状病毒NL63中的木瓜样蛋白酶2的抑制作用示意图。
[0012]图2是依布硒对人冠状病毒NL63中的木瓜样蛋白酶2的IC
50
的测定示意图。
[0013]图3是依布硒对人冠状病毒NL63中的木瓜样蛋白酶2的抑制剂类型示意图。
具体实施方式：
[0014]为了更好地说明本专利技术，在下面将详述本专利技术的具体实施方式。
[0015]1.人冠状病毒NL63中木瓜样蛋白酶2的表达与纯化
[0016](1)将含有编码HCoV
‑
NL63 PL
pro
2基因的pET
‑
28a(+)载体转化至Escherichia coliBL21(DE3)菌株，培养后筛选阳性克隆。
[0017](2)在含有卡那霉素抗性的平板上挑取阳性克隆，37℃培养6h后转入0.8L的LB培养基，再培养6小时后，加入终浓度为0.5mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，在16℃培养16小时。
[0018](3)用4000rpm离心30min收集细胞后高压破菌；破碎后12000rpm离心1h后收集上清液。
[0019](4)将上清液加入破菌buffer(20mM Tris
‑
HCl,250mM NaCl,pH 8.2)预平衡的Ni
‑
NTA亲和层析柱中并孵育2h，使目的蛋白与Ni充分结合。
[0020](5)用含有20mM咪唑的破菌buffer洗掉未结合的杂蛋白，用含250mM咪唑的破菌buffer洗脱目的蛋白，然后用10kDa的超滤管进行浓缩换液，之后用阴离子交换层析以及凝胶过滤层析进行进一步纯化均一的目的蛋白。
[0021]2.HCoV
‑
NL63 PL
pro
2的活性测定
[0022]采用RLRGG
‑
AMC作为底物，采用荧光共振能量转移的方法，设置激发光360nm，发射光460nm。
[0023]蛋白缓冲液组分为50mM Tris
‑
HCl,pH7.5，用缓冲液配置HCoV
‑
NL63PL
pro
2(终浓度1.6μM)，加入溶解于DMSO(二甲基亚砜)的依布硒(终浓度为20μM),室温放置2min，迅速加入底物RLRGG
‑
AMC，底物终浓度为160μM。300rpm震荡5s，每20s记录一次读数，测定50min，检测荧光值。阴性对照不加备选样品，其它实验条件均相同。
[0024]所有测定均做三次平行，在整个实验中保持合适的阳性和阴性对照。用酶标仪测定酶动力学曲线，分析初速率，计算出剩余活性和抑制率。
[0025]3.化合物依布硒IC
50
的测定
[0026]首先配制实验所需的终浓度为1.6μM的HCoV
‑
NL63 PL
pro
2蛋白，再用ddH2O配置底物RLRGG
‑
AMC,使其终浓度为160μM。我们首先根据活性测定结果的设定11个抑制剂浓度(一般是通过梯度稀释得到)，依布硒的终浓度分别是40μM、20μM、10μM、5μM、3μM、1μM、0.75μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.0625μM。活性测定方法与之前一致，先将蛋白加入酶标板中与不同浓度依布硒在室温孵育2min后，迅速加入10μL底物，记录时间与荧光值变化曲线。我们通过Graphpad prism 9软件计算得到蛋白酶吸光反应初速率，并拟合化合物浓度与剩余活性的量效关系曲线，得出IC
50
值。
[0027]4.化合物依布硒抑制剂类型的测定
[0028]在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.依布硒在治疗人冠状病毒NL63感染中的应用。2.依布硒是人冠状病毒NL63木瓜样蛋白酶2的小分子抑制剂。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，依布硒的结构式为：4.根据权利要求书1或2所述的治疗人冠状病毒NL63感染的药物，其特征是它的片状制备方法为混合，制粒，干燥，整粒，总混，压片。5.一种治疗人冠状病毒NL63感染的药物，其特征在于它包含权利要求书1或2所述的依布硒以及一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽方，张晓宇，肖云杰，封守琴，朱倩，
申请(专利权)人：天津国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：