快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针、方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针。本发明专利技术还公开了含有上述引物和探针的试剂盒，以及快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法。采用本发明专利技术的引物、探针和方法检测不同基因型的猪流行性腹泻病毒，特异性高、重复性好、灵敏度高，可快速准确地检测出猪流行性腹泻病毒的基因型。

Primers, probes and methods for rapid detection of genotype of porcine epidemic diarrhea virus

The invention discloses a primer and probe for rapid detection of the genotype of porcine epidemic diarrhea virus. The invention also discloses a kit containing the primers and probes, and a method for quickly detecting the genotype of porcine epidemic diarrhea virus. Using the primers, probes and methods of the invention to detect porcine epidemic diarrhea virus of different genotypes, it has high specificity, good reproducibility and high sensitivity, and can quickly and accurately detect the genotypes of porcine epidemic diarrhea virus.

【技术实现步骤摘要】
快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针、方法
本专利技术涉及病毒检测
，尤其是一种快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针、方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐和脱水为典型特征的一种急性高度接触性肠道传染病。哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各种年龄的猪均易感，但哺乳仔猪受害最为严重，死亡率最高可达100％。自从1971年英国首次报道猪流行性腹泻(PED)以来，相继在比利时、德国、加拿大、日本、瑞士等多个国家报道了本病的发生，我国从1976年开始就陆续有PED的报道，但临床危害较轻。该病2010年在我国大规模暴发，由于其发病率高、死亡率高(初生仔猪因水样腹死亡率可高达100％)，传播迅速，短短几年时间，造成我国生猪存栏量持续走低，给我国生猪养殖造成巨大经济损失的同时，也严重影响了国计民生。2014年该病由东南亚、东北亚逐步蔓延至美国(美国自2013年5月在爱荷华州发生PED以来的一段时间，每周损失10万头仔猪)、加拿大、墨西哥、乌克兰等欧美国家，给全球生猪养殖业造成灾难性损失，当前，该病仍呈全球流行态势。由于弱毒疫苗的广泛使用(中国：CV777；韩国KPED-9；日本：83P-5；美国：PEDv)，通过抗体检测很难确定猪群的实际感染情况，加之该病病原极难分离培养，因此对病原的分子检测便成为评估该病流行、发生态势及生物安全防控是否有效的主要手段。虽然PEDV所有分离株都呈单一血清型，但其主要抗原表位基因(纤突糖蛋白：S基因)却呈现不同区域特征，这其中以中国流行毒株多样性尤为明显(我国北方毒株与韩国、美国等地新发毒株相近、我国南方部分毒株与泰国等东南亚国家相近)。传统的病原检测技术很难将疫苗毒排毒与野毒感染进行区别(我国目前使用的疫苗毒虽然ORF3有部分缺失，可以作为PCR鉴别标记，但也存在韩国KPEDV-9在中国部分地区非法使用的情况，KPED-9无ORF3缺失)，更无法对流行的基因型进行鉴定。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括以下几个方面：作为本专利技术的第一个方面，本专利技术提供了快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：上游引物：GAACCCACTAACTTGGGTGT(SEQIDNO：1)；下游引物：AGGTTCAACAATCTCAACTA(SEQIDNO：2)；探针：ATCTGGACCTGCTGTTGCCATTGCC(SEQIDNO：3)，其中，所述探针的5‘端结合荧光报告基团，所述探针的3‘端结合荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5或TET，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。作为本专利技术的第二个方面，本专利技术提供了快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物和探针。作为本专利技术的第三个方面，本专利技术提供了快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法，包括以下步骤：1)从样品中提取病毒核酸；2)以核酸为模板，利用上述的引物和探针，进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。应当说明的是，上述方法并非用于猪流行性腹泻的诊断和治疗。优选地，所述RT-PCR扩增的反应体系为：其中，所采用的酶优选PrimeScript1StepEnzymeMix。优选地，所述步骤2)中RT-PCR扩增的反应程序如下：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s；循环45次。优选地，所述步骤3)HRM分析过程中，45℃到60℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。优选地，所述步骤3)HRM分析的具体判定标准为：以不同基因型PEDV质粒样品作为阳性对照，对被检样品进行分型鉴定，当被检样品和阳性对照中某种基因型的PEDV质粒之间探针峰的ΔTm值小于0.5℃时，判定被检样品和所述某种基因型的PEDV质粒为同一基因型。优选地，所述不同基因型PEDV包括4种基因型，分别为：CV777疫苗毒株、KPED-9疫苗毒株、PEDV/North野毒株和PEDV/South野毒株。综上所述，本专利技术的有益效果为：采用本专利技术的引物、探针和方法检测不同基因型的猪流行性腹泻病毒，特异性高、重复性好、灵敏度高，可快速准确地检测出猪流行性腹泻病毒的基因型；该检测方法省时省力，可信度高，为PEDV毒株的分离、鉴定以及后期弱毒疫苗的研发奠定了坚实的基础。附图说明图1为PEDV进化分型图；图2为4个基因型PEDV标准样品峰型化熔解曲线图；图3为采用PEDV-HRM分析方法检测本专利技术的引物特异性的试验结果；图4为实施例2的方法的PEDV/South野毒株荧光定量HRM灵敏度试验结果；图5为实施例2的方法的PEDV/North野毒株荧光定量HRM灵敏度试验结果；图6为实施例2的方法的KPED-9疫苗毒株荧光定量HRM灵敏度试验结果；图7为实施例2的方法的CV777疫苗毒株荧光定量HRM灵敏度试验结果；图8为PEDV四种不同基因型临床样品采用实施例2的方法检测的HRM峰型化熔解曲线图。具体实施方式为了控制PEDV的流行，需要建立一种快速鉴别PEDV疫苗毒株(CV777、KPED-9)与临床野毒，北方毒株(S基因含4161bp碱基)与南方毒株(S基因含4158bp碱基)的基因型的方法。本申请以PCR-高分辨熔解曲线分析技术(HRM)为技术依托，建立了一种基于探针的PEDV不同基因型熔解曲线分型检测技术，为PEDV的临床综合防控提供技术支撑。本申请的专利技术人对NCBI数据库中已公布的PEDV核酸序列进行多序列比对分析，寻找适合于区分PEDV疫苗毒株(CV777、KPED-9)与临床野毒株(North、South)的差异化位点，设计探针，建立区分PEDV四个基因型的实时荧光定量熔解曲线分析方法，通过对临床样品的检测结果，分析本专利技术的引物、探针、检测方法在临床检测中的应用价值。为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1HRM引物和探针根据2010-2014年临床鉴定的42例PEDV阳性病料S基因序列与NCBI中已公布的S基因序列的遗传进化分析结果，将PEDV分为四个基因型(如图1)。将GenBank中公布的PEDV全基因组序列依据不同基因型进行序列比对(blastx、Bioedit、MEGA等)，找到2株疫苗毒/野毒，中国南方流行毒株/北方流行毒株的特异性位点突变及信息，并以此为基础设计合引物及探针。本申请的专利技术人经过对所设计的大量引物和探针进行筛选后，发现采用下列HRM引物和探针检测猪流行性腹泻病毒的基因型的效果最好，其核苷酸序列如下所示：上游引物：GAACCCACTAACTTGGGTGT(SEQIDNO：1)；下游引物：AGGTTCAACAATCTCAACTA(SEQIDNO：2)；探针：6FAM-ATCTGGACCTGCTGTTGCCATTGCC-BHQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下：上游引物：GAACCCACTAACTTGGGTGT(SEQ ID NO：1)；下游引物：AGGTTCAACAATCTCAACTA(SEQ ID NO：2)；探针：ATCTGGACCTGCTGTTGCCATTGCC(SEQ ID NO：3)，其中，所述探针的5‘端结合荧光报告基团，所述探针的3‘端结合荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下：上游引物：GAACCCACTAACTTGGGTGT(SEQIDNO：1)；下游引物：AGGTTCAACAATCTCAACTA(SEQIDNO：2)；探针：ATCTGGACCTGCTGTTGCCATTGCC(SEQIDNO：3)，其中，所述探针的5‘端结合荧光报告基团，所述探针的3‘端结合荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5或TET，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。3.快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物和探针。4.快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从样品中提取病毒核酸；2)以核酸为模板，利用权利要求1或2所述的引物和探针，进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春红，张建峰，刘志成，沈海燕，孙俊颖，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44