利用基因置换技术改造力达霉素产生菌的方法技术

本发明专利技术涉及利用基因置换技术改造抗生素产生菌染色体以构建新型抗生素产生菌的方法，具体而言，是用力达霉素辅基蛋白基因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因（ｃａｇＡ），以获得能产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性的力达霉素重组菌株，利用重组菌株，可以直接发酵产生含有所述融合蛋白的力达霉素，无需使用常规大肠杆菌表达融合蛋白和ＬＤＭ体外拆分组装的制备方法，既可大大简化操作步骤，又可方便地用于制备具有不同肿瘤靶向性多肽的抗肿瘤导向药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用基因置换技术改造抗生素产生菌染色体以构建新型抗生素产生菌的方法， 具体而言，是用力达霉素辅基蛋白基因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因(caW)，以获得能产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性的力达霉素重组菌株。
技术介绍
一般抗癌药物的毒性很大，采用单抗偶联靶向给药可以减少毒副作用。单抗偶联物虽然具 有体内分布特异性，在肿瘤耙部位的浓度较高，但偶联物实际到达肿瘤细胞尤其是实体瘤深 部细胞的数量有限。这与肿瘤组织的特异性和偶联物分子的大小等因素有关。烯二炔类抗肿 瘤抗生素由于其很强的抗癌活性，更适于制备成为单抗导向药物。力达霉素是由球孢链霉菌(5&印to^ces ^o&邵orus C-1027)产生的一种具有极强抗肿瘤活性的新型烯二炔抗生素，由脂溶性发色团和辅基蛋白非共价键结合组成。烯二炔结构的发色团具有极强的细胞毒作用，辅基蛋白对发色团的稳定起保护作用。IV型胶原酶能够破坏基质的平衡，在多种人类肿瘤细胞以及肿瘤新生血管内皮细胞中均呈高表达。抑制IV型胶原酶的活性，即可抑制肿瘤细胞的侵袭转移和肿瘤血管的生成。研究表明，以源于抗IV型胶原酶单克隆抗体3G11单链抗体scFv或可分泌单域抗体VH等作为导向药物的载体，^^仅可以提供肿瘤靶向性，而且其自身就具有抑制肿瘤的效果。此外，含RGD (即Arg-Gly-Asp)的小肽能够特异性地与0￥03整合素结合，而0,03整合素在很多肿瘤组织中呈高表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关。所以，RGD等小肽亦可形成导向药物的载体。本研究所已将辅基蛋白与抗IV型胶原酶单链抗体融合蛋白(scFv-LDP)在中成功表达，表达出来的蛋白可以装配力达霉素的发色团，并在体外和动物体内试验中均获得很好 的效果。然而不足之处是，大肠杆菌所表达的融合蛋白集中在包涵体内，包涵体所含外源蛋 白未经正确折叠，也未形成正确折叠的二硫键， 一般不具有天然构象，也不具有生物活性， 所以必须在体外变性、复性以恢复其生物学活性。目前已经发展了上百种复性方法，但是没 有一种方法适用于所有外源蛋白的表达。大肠杆菌表达出来的Fv-LDP融合蛋白在应用之前， 需经过人工变性复性，以及发色团的体外装配等，工艺十分复杂。本专利技术的目的之一是，将力达霉素的辅基蛋白与具有肿瘤靶向性多肽如抗IV型胶原酶单链抗体scFv，或可分泌单域抗体vh进行偶联，形成融合蛋白。本专利技术的目的之二是，为使融合蛋白进一步小型化，构建了力达霉素辅基蛋白与肿瘤靶 向肽RGD的融合蛋白。通过同源重组构建重组菌株，再经发酵获得既具单抗靶向性，又有高效抗肿瘤活性的 scFv-LDM、 Vh—LDM、 RGD—LDM等，进而可为临床提供一种新的单抗靶向抗肿瘤药物。本专利技术所述利用基因置换技术改造抗生素-力达霉素产生菌染色体以构建新型抗生素产 生菌的方法，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。力达霉素的生物合成基因簇已被克隆(GenBank登录号AY048670)。力达霉素辅基蛋白基 因位于结构基因Al和A4之间，这为构建力达霉素的辅基蛋白与具有肿瘤靶向性多肽融合蛋 白的基因操作提供了有利条件。
技术实现思路
本专利技术提供了，即利用基因置换技术在力达霉 素产生菌5^r印tofflyces Wo6j'邵ot"s C-1027中，用力达霉素(lidamycin， LDM)辅基蛋白 基因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因 (ca^D，获得能够产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性融合蛋白的力达霉素重组菌株。 本专利技术所述改造抗生素产生菌的方法，其总体步骤是1. 确定编码靶向肽的核酸序列本专利技术所涉及的靶向肽选自多种来源，包括但不限于肿瘤特异性抗原的单链抗体、单域抗 体、具有肿瘤特异性结合活性的小肽等。本专利技术的一个优选实施方案中，所述靶向肽为抗IV 型胶原酶单链抗体序列；另一个优选实施方案中，所述靶向肽为抗IV型胶原酶单域抗体序列；再一个优选实施方案中，所述靶向肽为环RGD十肽序列；2. 设计相应引物，PCR方法扩增，获得编码靶向肽的基因片段；3. 基因置换载体的构建包括，用于同源双交换被置换基因两臂的PCR扩增、选择性标记基因片段的插入及与载体 的连接；4. 将基因置换载体导入C-1027产生菌；5. 重组菌株的筛选和鉴定用选择性标记进行筛选，以PCR、 Southern blot进行染色体基因置换的鉴定，SDS-PAGE 进行融合蛋白表达的检测；6. 基因置换重组菌株产生力达霉素的检测根据力达霉素抗微生物抑菌活性与抗肿瘤活性具平行性的特点(赵春燕等，中国抗生素杂志，2005， (30): 9)，将本专利技术所获含融合蛋白重组菌株，用本领域公知的方法，在适于 力达霉素产生的营养培养基和需氧培养条件下培养。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过 摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培 养。在所述条件下，发酵进行大约30-200小时后，优选进行80-140小时后结束发酵。在发酵 终点，通过监测发酵培养液的抑菌活性，监测重组菌株的生长状况。本专利技术按照上述步骤，首先分别设计引物，以5". Wo&'^70i7/s C-1027的总DNA为模板进行PCR反应，在力达霉素辅基蛋白基因(caW)终止密码子TGA两侧，扩增出用于双交换两臂的同源片段，以含有抗IV型胶原酶单链抗体质粒为模板，根据己知序列，PCR扩增抗IV型胶原酶单链抗体scFv;根据链霉菌偏好密码子合成单域抗体VH ;合成RGD十肽基因。将上述耙向多肽片段，分别与选择性抗性标记-阿普霉素抗性基因片段连入质粒载体，最终得到可以用于同源双交换的含靶向多肽-辅基蛋白基因(C3^J)的融合蛋白基因重组质粒。经验证无误后，转化Eco7i'，通过接合转移，转入5. WoAi印oras C-1027中，对于抗性筛选正确的转化子，经多次传代培养进行确认，最终获得重组菌株，其中的5". g乃W邵or^C-1027-scFv，已于2007年9月25日送交北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，编号为CGMCC No. 2187。本专利技术对重组菌株进行了 PCR、测序和Southern验证，结果确认构建正确。利用特定的培养基进行发酵，对发酵液进行SDS-PAGE分析表明，原辅基蛋白条带消失，融合蛋白呈现表达，抗菌活性检测也呈阳性。初步检测表明，重组菌株可以产生有活性的力达霉素。专利技术效果本专利技术在力达霉素产生菌5Yr印to^ces《A^/邵or^ C-1027中，用力达霉素辅基蛋白基 因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因 (ca^),获得能够产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性融合蛋白的力达霉素重组菌株。利用重 组菌株，可以直接发酵产生含有所述融合蛋白的力达霉素，无需使用常规大肠杆菌表达融合 蛋白和LDM体外拆分组装的制备方法，既可大大简化操作步骤，又可方便地用于制备具有不 同肿瘤耙向性多肽的抗肿瘤导向药物。 附图说明图l.重组菌株51. Wo6i卬o^A5 C-1027-scFv构建示意图其中E—同源重组左臂片段； G—同源重组右臂片段；ca^l—力达霉素辅本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用基因置换技术改造力达霉素产生菌的方法，其特征在于所述方法是将靶向性多肽与力达霉素辅基蛋白的融合基因取代力达霉素产生菌的辅基蛋白基因（ｃａｇＡ），构建产生既具靶向性又有抗肿瘤活性的力达霉素重组菌株。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：邵荣光，洪斌，李保卫，崔智慧，王丽非，胡云峰，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]