本发明专利技术涉及一种双单链抗体强化融合蛋白ｄＦｖ－ＬＤＰ－ＡＥ，它是由两个抗ＩＶ型胶原酶单抗３Ｇ１１的单链抗体ｓｃＦｖ、力达霉素辅基蛋白ＬＤＰ和力达霉素活性发色团ＡＥ组成，分子量为６７．１ｋＤａ，其融合蛋白ｄＦｖ－ＬＤＰ的基因编码序列为１９０５ｂｐ，由６３５个氨基酸组成；实验结果表明，它在体外具有强烈肿瘤细胞杀伤作用，在体内对小鼠移植性肝癌Ｈ２２和裸鼠移植性人肝癌Ｂｅｌ－７４０２有十分显著的疗效，小动物活体成像亦显其有更好的肿瘤靶向效果，为开发肿瘤导向药物创造了有利条件。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以连续两个单链抗体为载体的肿瘤导向融合蛋白及其制备方法 和在抗肿瘤耙向治疗药物中的应用。
技术介绍
IV型胶原酶能够降解IV型胶原等细胞外基质组分，破坏基底膜及细胞外基 质的完整性，与肿瘤生长、侵袭和转移有密切的关系。在人类前列腺癌、结直肠 癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等恶性程度较高的肿瘤细胞和组织中均存在IV 型胶原酶的高表达，而抑制其活性，可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。scFv是 抗体工程小型化过程中研究比较多的对象，它由一个重链可变区VH和一个轻链 可变区VL,通过15个小分子氨基酸短肽连接而成，其分子量约为27kDa。本发 明中所用的scFv是由本实验室开发出的一种抗IV型胶原酶单链抗体片段，其与 力达蛋白LDP组成融合蛋白后的分子量为37 kDa，与发色团组装后的免疫偶联 物Fv-LDP-AE，在荷瘤小鼠中展现了较好的治疗效果(专利号ZL 03 1 50240. 7)。高活性的'弹头'力达霉素(LDM)，亦称为C-1027，是从我国湖北省潜江 县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌(5Yr印tofflyces Wo6i印or^，菌种保藏 编号CGMCC No. 0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀 伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物实验表明，LDM对小鼠结肠癌 26有非常显著的疗效，对移植裸鼠的人肝癌Bel-7402 和胰腺癌等多种裸 鼠移植人肿瘤均有较好疗效。力达霉素由两部分组成一为烯二炔发色团(active enediyne, AE)，具有细胞毒作用，是力达霉素的效应基团，但是不太稳定；另 一部分为110个氨基酸组成的辅基蛋白(LDP)，其对发色团的稳定起到保护作用。 发色团和辅基蛋白，两者通过非共价键结合，在有机溶剂中可以拆分为二，还可 以重建。因此，力达霉素以其独特的分子结构，可以成为构建新型单抗导向药物的理想'弹头'药物。小型化、高效化是解决当前抗体药物治疗所遇到问题的有效途径之一。然而， 小型化却不可避免造成亲和力的降低和在体内停留时间的縮短，从而导致药物在 肿瘤部位积累的相对比例下降。本专利技术所涉及的dFv LDP-AE,是以连续的两个 抗IV型胶原酶单抗3G11的单链抗体scFv为载体，强效抗肿瘤抗生素力达霉素 为'弹头'，采用DNA重组和分子重建技术相结合而制备的肿瘤导向免疫融合蛋 白。研究表明，dFv-LDP-AE在体外对肿瘤细胞有强烈的杀伤活性，体内实验对 小鼠移植性肝癌22和裸鼠移植性人肝癌Bel-7402均有很显著的疗效，相对于先 前构建的类似融合蛋白Fv-LDP-AE (专利号ZL 03 1 50240.7)有更好的抑瘤 效果。小鼠活体成像显示，dFv-LDP较Fv-LDP有更好的组织分布行为，在肿瘤 部位能够快速、长时间富集。本专利技术所说的双单链抗体强化融合蛋白 dFv-LDP-AE，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。本专利技术的目的是，提供一种相对于单链抗体强化融合蛋白来讲，亲和力更高， 体外肿瘤细胞杀伤活性更强，体内抗肿瘤治疗效果更好的双单链抗体强化融合蛋 白dFv-LDP-AE，为肿瘤靶向治疗实用化创造有利条件。
技术实现思路
本专利技术涉及的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE系由两个抗IV型胶原酶 单抗3G11的单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团AE 组成，分子量为67. 1 kDa，其融合蛋白dFv-LDP的基因编码序列为1905 bp，由 635个氨基酸组成。 本专利技术的技术方案包括以下步骤1、重组表达质粒pET-dFv-LDP的构建重组质粒沐Fvl027含有scFv和LDP 基因，由本实验室构建。大肠杆菌菌种￡co". DH5a和大肠杆菌表达质粒 pET-30 a(+)为本试验保存的Invitrogen公司的产品。PCR引物由北京英俊公司 合成，分别引入相应的酶切位点。 单链抗体scFv两条5'端引物(Pal和Pa2):Pal: 5， -GGAATTCCATATGCAGGTGAAGCTGCAG-3'(下划线为Nde I酶切位点)； Pa2: 5' -CCGGAATTCCAGGTGAAGCTGCAGCAGT-3， (下划线为EcoR I酶切位点)单链抗体scFv两条3'端引物(Pbl和Pb2):Pbl:5' -CCGGAATTCTGAACCGCCTCCACCACGTTTGATTTCCAGCTT-3 ，(下划线为EcoRI酶切位点)Pb2: 5' -CCCAAGCTTACGTTTGATTTCCAGCTT-3 (下划线为Hind III酶切位点)LDP 5'端引物(Pel):'(下划线为Hind III酶切位点)LDP 3'端引物(Pc2):5' -CCGCTCGAGTGAACCGCCTCCACCGCCGAAGGTCAGAGCCACGT-3， (下划线为Xho I酶切位点)以重组质粒沐Fv1027为模板，Pal为5'端引物，Pa2为3，端引物；同时以Pbl为5'.端引物，Pb2为3'端引物，进行PCR扩增，获得两个有不同酶切位点的scFv基因片段。与此同时，以重组质粒pKFvl027为模板，Pel为5'端引物，Pc2为3'端引物，进行PCR扩增，获得LDP基因片段。PCR反应体系为94。C预变性4分钟，然后94。C变性45秒，56。C退火45秒，72。C延伸45秒，进行28个循环的扩增反应，最后72'C延伸10分钟。三种PCR产物scFvl、 scFv2、 LDP电泳后，利用博人泰克公司的DNA片段玻璃奶回收试剂盒切胶纯化回收，然后分别进行Nde I/EcoR I、 EcoR I/Hind III、Hind III/Xho I双酶切，释放出具有不同粘末端的scFvl、 scFv2、 LDP片段，然后与采用Ndel/Xho I双酶切的载体pET-30(a+)进行连接，16'C连结过夜后转化大肠杆菌DH5a ，筛选出重组克隆质粒，进行酶切鉴定并送北京英俊公司测序，质粒构建流程见(图l)。结果表明，融合基因重组表达质粒pET30a(+)/dFv-LDP的酶切结果和测序结果与预期完全一致，融合蛋白的基因编码序列为1905bp，由635个氨基酸组成，序列正确。本专利技术在力达霉素辅基蛋白LDP基因3'端增引入了 Xho I酶切位点，恰好可以利用质粒pET-30a(+)多克隆位点3'端6个连续的组氨酸标签肽(His厂Tag)的密码子，使得表达蛋白的C'末端融合有His6-Tag，便于纯化和鉴定。2、 融合蛋白clFv-LDP在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLys中的诱导表达本专利技术使5用的大肠杆菌Rosetta(DE3)pLys为Novagen公司产品。以构建好的重组质粒 pET-dFv-LDP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLys，得到重组转化菌。挑取单克隆接 种到含有50 ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37'C培养过夜，次日以l: 20接 种，37'C培养到006。。为0. 7时，往培养基中加入终浓度为0. 2 mM的异丙基- g -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导培养3小时，按pET系统操作手册(Novagen，第 九版)分别制备全细胞蛋白组分、可溶性细胞质和不可溶性细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双单链抗体强化融合蛋白ｄＦｖ－ＬＤＰ－ＡＥ，其特征是所述ｄＦｖ－ＬＤＰ－ＡＥ系由连续的２个抗ＩＶ型胶原酶单抗３Ｇ１１的单链抗体ｓｃＦｖ、力达霉素辅基蛋白ＬＤＰ和力达霉素活性发色团ＡＥ组成，其分子量为６７．１ｋＤａ，融合蛋白ｄＦｖ－ＬＤＰ的基因编码序列为１９０５ｂｐ，由６３５个氨基酸组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苗庆芳，吴淑英，张胜华，甄永苏，钟根深，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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