【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及突变体斑马鱼在制备凝血功能障碍疾病的动物模型中的应用。
技术介绍
1、crispr-cas基因编辑技术是对特定位点进行基因编辑的技术，利用crispr-cas技术在某一特定位点导入目的基因，可以使有基因缺陷的细胞恢复正常功能，也可以在正常细胞内导入疾病相关基因从而构建相应疾病模型。研究发现使用多个sgrna靶向同一基因，可以最大限度地提高编辑效率，并将这种方法命名为crispant技术。血液系统疾病多半由于基因突变引起。利用crispant技术可研究人类血液疾病的遗传背景，矫正致病的突变基因，发现更多与血液疾病预后相关的基因，有望治愈血液恶性疾病；此外，还可构建更接近人体生理特性的个体化血液疾病模型，也有利于进行新药开发试验。
2、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pacap)是一种在脊椎动物中高度保守的多能神经肽，广泛分布于哺乳动物中枢神经系统(cns)。它发挥着多种生理作用，包括调节神经传递、免疫、发育和分化。研究表明pacap作为一种血管活性神经肽在几种神经疾病中的重要性。pacap属于血管活性肠肽(vip)/分泌素/胰高血糖素家族，由前体的选择性剪接衍生而来，并以两种具有生物活性酰胺化形式产生，即pacap27和pacap38。pacap的作用是通过三种主要受体介导的：pac1受体(pac1r)、vpac1受体(vpac1r)和vpac2受体(vpac2r)，它们都属于g蛋白偶联受体组。pacap亚型及其受体的表达已在中枢神经系统中观察到，同时也在包括血管在内的外周器官中表达。pacap的
3、斑马鱼与哺乳动物的凝血系统高度相似，是一种广泛用于研究止血和凝血的模型。在斑马鱼中，pacap基因(adcyap1)发生了复制，产生了两个拷贝：编码pacap1的adcyap1a和编码pacap2的adcyap1b，adcyap1b mrna主要在大脑中表达。但是对于斑马鱼adcyap1b基因是否影响凝血功能，以及突变后是否导致凝血功能改变尚不清楚。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于弥补现有技术的不足，提供突变体斑马鱼在制备凝血功能障碍疾病的动物模型中的应用。
2、为了解决上述问题，本专利技术提供了突变体斑马鱼在制备凝血功能障碍疾病的动物模型中的应用，其特征在于，所述突变体斑马鱼为adcyap1b突变体斑马鱼。
3、优选的，所述adcyap1b突变体斑马鱼为斑马鱼adcyap1b基因第2号外显子中第207位至222位碱基缺失并插入tgggac；
4、或，斑马鱼adcyap1b基因第2号外显子中第208位至233位碱基缺失并插入taggt。
5、优选的，所述adcyap1b突变体斑马鱼表现症状为：凝血因子v、凝血因子ix、抗凝蛋白c和纤溶酶的表达量降低。
6、优选的，所述纤溶酶为纤维蛋白溶解系统的纤溶酶。
7、优选的，所述的凝血功能障碍疾病是由adcyap1b基因的异常表达引起。
8、优选的，所述的adcyap1b突变体斑马鱼通过如下方法制备得到：
9、将sgrna组合和cas9蛋白的混合物注射到斑马鱼的受精卵中，选出有效敲除的胚胎，培养至成鱼，获得f0代突变斑马鱼；
10、将所述f0代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到f1代胚胎，筛选所述f1代胚胎存在突变的胚胎，培养至成鱼，得到所述adcyap1b突变体斑马鱼；
11、所述sgrna组合包括sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4；所述sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4的核苷酸序列分别如seq id no.1至seq id no.4所示。
12、优选的，所述sgrna组合和cas9蛋白混合物中sgrna组合的浓度为200ng/μl，cas9蛋白的浓度为400ng/μl。
13、优选的，选出有效敲除的胚胎的方法包括如下步骤：
14、取发育至24hpf的受精卵，制备基因组dna；
15、以所述基因组dna为模板，利用上游扩增引物和下游扩增引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
16、将所述pcr扩增产物与野生型adcyap1b基因比对，若扩增结果不同，则发育至24hpf的受精卵为有效敲除的胚胎；
17、所述上游扩增引物包括如seq id no.5所示的核苷酸序列；所述下游扩增引物包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。
18、优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min。
19、有益效果
20、本专利技术使用crispant技术构建了敲除adcyap1b基因(哺乳动物pacap的直系同源物)的斑马鱼模型，adcyap1b突变体斑马鱼表现出严重的出血和凝血障碍，并且，检测adcyap1b突变体斑马鱼体内凝血因子以及参与抗凝和纤维蛋白溶解系统的基因的表达情况发现，与凝血因子v、凝血因子ix、抗凝蛋白c和纤维蛋白溶解系统的纤溶酶原有关的转录本明显下调，本专利技术提供的adcyap1b突变体斑马鱼作为凝血功能障碍疾病的动物模型，为adcyap1b基因突变与凝血功能障碍疾病发病机制的关系研究及筛选抗血栓药物奠定了很好的基础。
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1.突变体斑马鱼在制备凝血功能障碍疾病的动物模型中的应用，其特征在于，所述突变体斑马鱼为adcyap1b突变体斑马鱼。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述adcyap1b突变体斑马鱼为斑马鱼adcyap1b基因第2号外显子中第207位至222位碱基缺失并插入TGGGAC；
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述adcyap1b突变体斑马鱼表现症状为：凝血因子V、凝血因子IX、抗凝蛋白C和纤溶酶的表达量降低。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述纤溶酶为纤维蛋白溶解系统的纤溶酶。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的凝血功能障碍疾病是由adcyap1b基因的异常表达引起。
6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述的adcyap1b突变体斑马鱼通过如下方法制备得到：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述sgRNA组合和Cas9蛋白混合物中sgRNA组合的浓度为200ng/μL，Cas9蛋白的浓度为400ng/μL。
8.根据权利要求6
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min。
...【技术特征摘要】
1.突变体斑马鱼在制备凝血功能障碍疾病的动物模型中的应用，其特征在于，所述突变体斑马鱼为adcyap1b突变体斑马鱼。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述adcyap1b突变体斑马鱼为斑马鱼adcyap1b基因第2号外显子中第207位至222位碱基缺失并插入tgggac；
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述adcyap1b突变体斑马鱼表现症状为：凝血因子v、凝血因子ix、抗凝蛋白c和纤溶酶的表达量降低。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述纤溶酶为纤维蛋白溶解系统的纤溶酶。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的凝血功能障碍疾...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩莹，马媛媛，张靖溥，马鑫彦，张锐，杜纪阳，刘可慧，刘馨妍，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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