System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 一种sgRNA组合及其应用制造技术_技高网

当前位置: 首页 > 专利查询>中国医学科学院医药生物技术研究所专利>正文

一种sgRNA组合及其应用制造技术

技术编号：40545853 阅读：4 留言：0更新日期：2024-03-05 19:03

本发明专利技术属于基因敲除技术领域，具体涉及一种sgRNA组合及其应用。本发明专利技术提供了一种sgRNA组合，包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4中所示的核苷酸序列。本发明专利技术通过Crispant技术，设计sgRNA组合，能够敲除斑马鱼atp7b基因第8号外显子上的片段，选育出atp7b基因缺失型斑马鱼，从而构建威尔逊病斑马鱼模型。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因敲除，具体涉及一种sgrna组合及其应用。

技术介绍

1、atp7b蛋白属p型atp酶超家族，由位于第13号染色体长臂(13q14.3～q21.1),全长约85kb的atp7b基因编码，atp7b蛋白对调控和调节细胞内铜离子的代谢和平衡至关重要。现已证明，突变或缺失的atp7b基因会导致威尔逊病(wilsondisease,wd)(the wilsondisease gene is a putative copper transporting p-type atpase similar to themenkes gene.pmid:8298639)(thewilsondisease gene is acoppertransportingatpasewithhomology to the menkes disease gene.pmid:8298641)，这是一种常染色体隐性遗传的铜代谢紊乱疾病。atp7b基因突变或缺失引起atp7b蛋白质功能异常，使得机体内的游离铜排泄减少，大量铜蓄积于肝、脑、肾、骨关节、角膜等组织和脏器，因而wd患者在临床上会表现出神经系统症状、急性或慢性肝衰竭和/或精神症状。目前，有学者利用exon1中缺失5bp的atp7b-/-斑马鱼突变体证明atp7b缺失会导致斑马鱼眼睛发育缺陷，但是结合wd患者的临床症状，尚未有研究表明atp7b基因的缺失对其他组织和器官的影响。通过构建斑马鱼突变体模型，可为进一步探讨atp7b基因的缺失是通过哪些机制影响其他组织和器官的正常生理功能提供实验材料。</p>

2、现阶段，对atp7b基因在斑马鱼中作用的主要研究方法是吗啉代修饰的反义寡核苷酸技术(morpholino)介导的基因敲降方法。该技术方法虽然可快速研究目的基因功能，但也存在缺点：1.敲降效果可能在不同细胞类型和不同目标基因之间变化较大。2.可能存在非特异性影响其他非目标rna或蛋白质的副作用。3.在mrna水平减低基因表达，仍有基因表达产物发挥作用，某些特殊的表型不易被观察。4.只能短期降低斑马鱼体内目的基因的表达，无法实现长期观察由于基因表达缺失造成的功能障碍。5.morpholino在一些情况下可能会对细胞或生物体产生毒性效应，高浓度或长期的morpholino暴露可能导致不良的细胞反应或影响胚胎发育。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于弥补现有技术的不足，提高斑马鱼atp7b基因的敲除效果，选育出atp7b基因缺失型斑马鱼，构建威尔逊病斑马鱼模型。

2、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种sgrna组合，包括sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4；所述sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4的核苷酸序列分别如seq id no.1至seq idno.4所示。

3、本专利技术还提供了上述技术方案所述的sgrna组合在构建威尔逊病斑马鱼模型中的应用。

4、本专利技术还提供了一种构建威尔逊病斑马鱼模型的试剂盒，包括上述技术方案所述的sgrna组合。

5、优选的，所述试剂盒还包括cas9蛋白。

6、本专利技术还提供了一种威尔逊病斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：

7、将上述技术方案所述的sgrna组合和cas9蛋白的混合物注射到斑马鱼的受精卵中，选出有效敲除的胚胎，培养至成鱼，获得f0代突变斑马鱼；

8、将所述f0代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到f1代胚胎，筛选所述f1代胚胎中存在突变的胚胎，培养至成鱼，得到可遗传的斑马鱼突变体。

9、优选的，所述sgrna组合和cas9蛋白混合物中sgrna组合的浓度为300ng/μl，cas9蛋白的浓度为400ng/μl。

10、优选的，所述sgrna组合和cas9蛋白混合物中sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4的质量比为1：1：1：1。

11、优选的，选出有效敲除的胚胎的方法包括如下步骤：

12、取发育至24hpf的受精卵，制备基因组dna；

13、以所述基因组dna为模板，利用上游扩增引物和下游扩增引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

14、将所述pcr扩增产物与野生型atp7b基因比对，若扩增结果不同，则发育至24hpf的受精卵为有效敲除的胚胎；

15、所述上游扩增引物包括如seq id no.5所示的核苷酸序列；所述下游扩增引物包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。

16、优选的，所述pcr扩增的程序为：96℃预变性3min；96℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min。

17、有益效果：

18、本专利技术提供了一种sgrna组合，所述sgrna组合包括sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4。本专利技术的sgrna组合能够用于crispant特异性敲除斑马鱼atp7b基因，构建斑马鱼突变体模型，通过crispant技术，敲除斑马鱼atp7b基因第8号外显子上的基因片段，选育出atp7b基因缺失型斑马鱼，从而构建斑马鱼突变体模型。本专利技术使用多个sgrna靶向同一基因，可以最大限度地提高编辑效率，更有效进行基因编辑，可以在目标基因dna水平的插入或缺失多种核酸序列，产生的每个个体中存在不同基因型的细胞，揭示基因功能；基因敲除的dna位点能在斑马鱼稳定遗传，表型观察不受时间限制，可快速大批量进行基因筛选。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种sgRNA组合，其特征在于，所述sgRNA组合包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4；所述sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的sgRNA组合在构建威尔逊病斑马鱼模型中的应用。

3.一种构建威尔逊病斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的sgRNA组合。

4.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas9蛋白。

5.一种威尔逊病斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA组合和Cas9蛋白混合物中sgRNA组合的浓度为300ng/μL，Cas9蛋白的浓度为400ng/μL。

7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA组合和Cas9蛋白混合物中sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4的质量比为1：1：1：1。

8.根据权利要求5所述的构

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃3min，35×(95℃30s，56℃30s，72℃30s)，72℃10min，4℃。

...

【技术特征摘要】

1.一种sgrna组合，其特征在于，所述sgrna组合包括sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4；所述sgrna1、sgrna2、sgrna3和sgrna4的核苷酸序列分别如seq id no.1至seq id no.4所示。

2.权利要求1所述的sgrna组合在构建威尔逊病斑马鱼模型中的应用。

3.一种构建威尔逊病斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的sgrna组合。

4.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas9蛋白。

5.一种威尔逊病斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩莹，张靖溥，杜纪阳，刘可慧，马媛媛，张锐，马鑫彦，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人

相关技术

网友询问留言已有0条评论

还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1

发布您的意见

相关领域技术