本发明专利技术“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其通过结合引物3’端的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3’末端非特异性的扩增，所述的反义寡核苷酸是特指一段4-14base由反义碱基组成的寡聚核苷酸。其基本特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能，但失去了作为PCR扩增模板和引物功能，通过纳米微球固相化反义寡核苷酸来间接固相化引物于PCR系统缓释热启动，配合矿物油封闭PCR而杜绝气雾胶交叉污染，使PCR反应不会产生非特异性扩增。反义寡核苷酸适用于有引物退火、延伸的各种PCR技术包括阵列扩增技术。
Antisense oligonucleotides inhibiting nonspecific amplification of primer
The invention relates to inhibiting primer non-specific amplification of antisense oligonucleotides, antisense oligonucleotide interference \by combining the primer 3 'end to interfere with PCR primer 3' end nonspecific, the antisense oligonucleotide is specific to a 4-14base by antisense oligonucleotide base composition. The basic features of antisense oligonucleotide retain Watson base base pairing hybrid performance, but lost as the template for PCR amplification and primer function by nanoparticles immobilized antisense oligonucleotide to indirect immobilized primer for slow release heat PCR system to start with mineral oil closed PCR and put an end to aerosol glue cross contamination, the PCR reaction does not produce non specific amplification. Antisense oligonucleotides are suitable for all kinds of PCR technology with the primer annealing and extension, including array amplification.
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增
，具体涉及通过反义“死”寡核苷酸竞争非特异性模板来干扰引物聚合等非特异性扩增的
技术介绍
:核酸扩增技术起源于1971年，Korana首先提出核酸体外扩增设想:“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。其思想种子进入到现代分子生物学发展的土壤就会生根、发芽。终于1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感:于试管中模拟天然的DNA体内指数式复制过程。其基本原理:提供一种合适的条件一模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的专利技术、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR专利技术专利(US Patent4，683，202)。核酸扩增PCR反应由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:拟扩增的模板DN A经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸:升温至72°C左右，DNA模板一引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原理，按5’ -3’方向合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链，不断重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。一般PCR进行30个循环就能将待扩目的基因呈指数扩增放大数百万倍以上，超过30个循环引物二聚体非特异性扩增就极剧增加。反应最终的DNA扩增量可用Y =(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，η代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期PCR产物逐渐增加，进入一定循环后靶序列DNA片段的增加呈指数形式即对数期，随着扩增产物的累积及PCR成份的消耗，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，达到“停滞效应”平台期。随着1985-1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到Taq耐热DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。PCR技术已成为生命科学领域最重要的核心基础技术，Kary Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。在以后的二十年里，多达数十种PCR新改进，新方法不断涌现，被专利技术，包括反转录 PCR (RT-PCR)，原位 PCR,连接酶链反应(Ligase chain reaction, LCR)，标记PCR(Labeled primers, LP-PCR),反向 PCR(reverse PCR,扩增两引物外侧未知序列)，不对称 PCR(asymmetric PCR),降落 PCR(touchdown PCR),重组 PCR(recombinant PCR),巢式 PCR(nest PCR)，多重 PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA 差异 PCR，链替换扩增(Strand displacement amplification, SDA),依赖核酸序列的扩增(Nucleicacid sequence-based amplification, NASBA),转录依赖的扩增系统(Transcript-basedamplification system, TAS), Q β 复制酶(Q-beta replicase)催化 RNA 扩增，滚环扩增(Rolling circle amplification, RCA),环介导的等温扩增(Loop mediated isothermalamplification, LAMP)等，尤其是各种实时荧光PCR(Real-time PCR)技术的发展实现了从定性测定到精确定量的飞跃，如荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR和各种荧光探针Taqman(Hydrolysisprobe) ,FRET Hybridition probes,and Molecular Beacons PCR,详见综述(Maisa L.Wong and Juan F.Medrano, BioTechniques39:75-85, July 2005)。核酸扩增技术不仅极大提升了基因克隆技术也提高了核酸检测灵敏度、效率，PCR应用已拓展到生物学的众多领域。PCR技术已不是单一技术方法，而是包括一系列理论、方法学及应用的新学科。详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年)，PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究，及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，已成为二十一世纪生物学最核心的基础技术。近年来，在PCR基础上为提高检测效率而发展出了许多增加热循环速度的快速微流体缩微PCR(lab-on-chip)和多重靶检测的高通量纳升PCR芯片(PCR-on_chip)，详见论文SURVEYand SUMMARY, Da Xing (2007) Nucleic Acids Res.，Vol.35，N0.13，p4223_4237，截至目前全世界PCR专利或相关的设计更是多达四至五位数以上。综上，常规终末检测PCR只能定性分析，灵敏度不够，低于1000拷贝数标本测不了否则引物二聚体非特异性扩增导致假阳性结果，以及扩增产物汽雾胶再污染所致假阳性等难题，常规PCR加产物凝胶电泳检测方法难以适用临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(产物标记荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cycle threshold)与祀模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。扩增产物增加的信号既可通过产物DNA结合荧光染料显示，如基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR(US Patent6, 569, 627);又可采用带淬灭基团的荧光探针来检测。被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国PE公司研制出了 Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量 PCR 技术(Livak KJ，et al.，1995，Genome Res:4:357_362)，于 19本文档来自技高网...
【技术保护点】
“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于能结合引物3’端的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3’末端非特异性的策略，所述的反义寡核苷酸是特指一段4?14base由反义碱基组成的寡聚核苷酸，其关键特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能，但失去了作为PCR扩增模板和引物功能，反义干扰寡核苷酸与非特异性模板竞引物而PCR热循环条件下不能与特异靶模板竞争引物，使一对引物PCR反应内不会产生引物二聚体非特异性扩增，反义寡核苷酸适用于有引物结合、延伸的各种PCR技术包括阵列扩增等技术。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江洪，岳素文，阮志强，江必胜，江雨康，
申请(专利权)人：北京万达因生物医学技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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