用于核酸等温扩增的改进方法技术

本发明专利技术公开了用于改进的核酸等温扩增的方法，所述方法包括在预定条件下从基质释放出必要组分的步骤。此外，本发明专利技术涉及试剂盒，所述试剂盒包含嗜中温酶和包埋有用于等温扩增的必要组分的基质。本发明专利技术还公开了包含基质和嗜中温酶的组合物，和用于包埋嗜中温酶的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及等温核酸扩增领域。
技术介绍
近年来，用于核酸扩增和检测扩增产物的方法的发展已经推进了核酸序列的检测、鉴定、定量和序列分析。核酸分析可用于检测和鉴定病原体、检测导致确定的表型的基因改变、诊断遗传性疾病或对疾病的易感性、评估在发育和疾病中的基因表达和对确定的刺激作出响应的基因表达、以及各种基因组项目。核酸扩增方法的其它应用为检测稀少的细胞、检测病原体和检测恶性肿瘤中改变的基因表达等。核酸扩增有可能可用于定性分析例如检测确定的核酸序列的存在，以及确定的基因序列的定量。后者可用于评估致病序列和确定致病序列的量以及确定基因重复或缺失，这些在正常细胞类型转化成恶性细胞类型的细胞转化中是常见 的。检测核酸序列中的序列改变对于检测突变基因型来说是重要的，所述突变基因型与遗传分析、对导致耐药性的突变的检测、药物基因组学等是有关的。用于检测特异性突变的各种方法包括等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性探针连接和差异探针杂交。尽管通过探针杂交可以检测确定的核酸序列的存在以及进行序列分析，但是当在测试样品中存在少量核酸序列例如几个分子时，该方法通常缺乏灵敏度。这个问题的一种解决方案是开发用于产生确定的核酸序列的多拷贝的方法，该多拷贝适合于进一步分析。用于产生特定核酸序列的多拷贝的方法通常被定义为祀扩增方法(target amplificationmethod)。存在核酸扩增的多种变体，例如指数扩增、连锁的线性扩增、基于连接的扩增和基于转录的扩增。指数核酸扩增方法的实例是聚合酶链反应(PCR)，其已被公开于众多出版物中(参见，例如，Mullis 等，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986);Mullis K. EP-B2201184 ;Mullis等，US4, 582，788)。基于连接的扩增的实例是Wu等在Genomics4:560 (1989)中公开的连接扩增反应(LAR)和公开在EP-B10320308中的连接酶链反应。公开了多种基于转录的扩增方法。最常用的靶扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，其基于变性、两个各自针对靶链的相反链的寡核苷酸引物的杂交、和由核苷酸聚合酶进行的引物延伸的多个循环，以产生靶序列的多重双链拷贝。已经描述了 PCR的许多变体，并且所述方法正用于扩增DNA或RNA核酸序列、测序、突变分析等。还已经描述了采用单个引物的基于热循环的方法。其它依赖于热循环的方法为连接酶链反应(LCR)和有关的修复链反应(RCR)。在基于热循环的方法中，通过在多个温度下孵育的多个循环来进行靶核酸扩增。尽管这些方法被广泛使用，但是使用热循环过程的扩增方法具有延隔时间长的缺点，延隔时间是热循环模块达到每个循环的“靶”温度所需要的时间。因此，使用热循环过程进行的扩增反应需要大量时间来完成。等温靶扩增方法不需要热循环仪，并且因此更容易适应常见的仪器平台。然而，等温靶扩增方法具有几个缺点。等温靶扩增方法易于出错。除了扩增靶区域外，由于引物错配而出现非特异性扩增产物。为了避免产生这些副产物，将反应组分分开加热并在在更高温度下进行混合，例如将包含引物、探针和靶DNA的混合物与包含缓冲液、聚合酶、dNTP和解旋酶的另一混合物分开加热至反应温度。这样的方法费时费力并且复杂。因此，需要克服这些缺点的改进的核酸扩增方法。在此提供的本专利技术满足这种需求并提供了另外的益处。
技术实现思路
本专利技术提供用于核酸扩增的方法，所述方法包括以下步骤i)至少提供以下反应组分a)用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶； b) 一个或多个用于扩增靶核酸的引物；c ) dNTP 和 / 或 NTP ;d)至少一种用于在等温条件下扩增核酸的酶的必要辅助因子和/或试剂；e)靶核酸；其中将反应组分a)至e)中的至少一种包埋在基质中，其中所述基质在预定条件下崩解；ii)在导致所述基质崩解的条件下孵育反应组分，以便获得反应混合物；iii)在适用于等温扩增反应的条件下孵育反应混合物。本专利技术还涉及用于核酸等温扩增的试剂盒，所述试剂盒包含-用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶，-在预定条件下崩解的基质；其中至少一种对于核酸等温扩增必要的组分被包埋在所述基质中。本专利技术还涉及组合物，其包含-在预定条件下崩解的基质；和-用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶。本专利技术还包括包埋用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶的方法，其包括以下步骤i)提供溶解的基质；ii)将所述基质与包含至少一种用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶的溶液混合以获得基质-酶混合物；iii)在允许基质固化的条件下孵育基质-酶混合物以获得包埋的嗜中温酶。具体实施例方式在此处，“嗜中温”是指酶的最适温度为70°C以下。在优选的实施方式中，所述至少一种用于扩增核酸的嗜中温酶的最适温度为20°C至70°C，优选30°C至65°C，更优选37°C至60°C。在大部分情况下，嗜中温酶不是热稳定的，即它们在高温下孵育后不可逆地失活。在实施方式中，本专利技术的嗜中温酶不是热稳定的。在上下文中，嗜中温酶在高温下不可逆失活是指在高于酶的最适温度的温度下孵育该酶。在一个实施方式中，在高温下孵育是指在至少50°C的温度下、优选在至少60°C的温度下、更优选在至少70°C的温度下孵育。“不可逆失活”是指一定程度的酶活性丧失。此外，所述失活并不必然是完全失活，即在高温下孵育嗜中温酶后可观察到70%以下、优选40%以下、更优选10%以下的剩余酶活性。本领域技术人员将认识到，嗜中温酶在高温下的失活可取决于孵育进行的时间。因此，在优选的实施方式中，在高温下孵育至少30秒、优选至少I分钟、更优选至少5分钟、甚至更优选至少15分钟之后，嗜中温酶不可逆地失活。本领域技术人员将理解，本专利技术的方法允许确定等温扩增反应的起点。因为该反应的必要组分例如酶被包埋在所述基质中，因此，它与反应缓冲液中的其它反应化合物例如模板核酸分开。这允许确定随着基质崩解而开始反应的时间点和/或条件。本专利技术的基质在预定条件下崩解，即当转变成所述条件时，它释放出包埋的化合物。所述基质可以被例如酶崩解、化学崩解或物理崩解。在本专利技术的一个实施方式中，所述基质通过pH的转变而崩解。在本专利技术的优选的实施方式中，通过PH的变化来改变所述基质的静电荷，导致释放出包埋的等温扩增反应的必要组分。在优选的实施方式中，通过扩散释放出至少一种包埋在所述基质中的反应组分。这允许恒定释放所述至少一种包埋的反应组分。此外，通过所述基质的酶崩解，可实现所述至少一种包埋的反应组分的恒定释放。因此，在本专利技术的优选的实施方式中，通过添加选自胶原酶、透明质酸酶、琼脂酶、褐藻酸酶和淀粉酶的酶使所述基质崩解。在本专利技术的一个实施方式中，所述基质在预定温度下崩解。在优选的实施方式中，所述基质在50°C以上、优选60°C以上、更优选65°C以上的温度下崩解。特别优选地，所述基质崩解的预定温度高于至少一个引物、优选所有引物的退火温度即大约Tm。这允许热启动等温扩增反应，因为在引物与非靶序列非特异性结合的温度下，反应没有开始。由此减少了非特异性扩增产物。退火温度是寡核苷酸引物和DNA模板在超过该温度时熔融或解离的温度。退火温度可以随模板和引物之间的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.10 EP 10172400.3;2010.08.10 US 61/372,3331.用于核酸等温扩增的方法，所述方法包括以下步骤i)至少提供以下反应组分a)用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶；b)一个或多个用于扩增靶核酸的引物；c)dNTP 和 / 或 NTP ；d)用于在等温条件下扩增核酸的酶的必要辅助因子和/或试剂；e)至少一种祀核酸；其中将反应组分a)至e)中的至少一种包埋在基质中，其中所述基质在60°C以上、优选 65°C以上的温度下崩解；ii)在导致所述基质崩解的条件下孵育反应组分，以便获得反应混合物；iii)在适用于等温扩增反应的条件下孵育反应混合物；其中在步骤ii)下的孵育温度比步骤iii)的孵育温度高1°C至50°C，优选高5°C至 25°C，更优选高10°C至20°C。2.权利要求1的方法，其中用于扩增核酸的嗜中温酶的最适温度为20°C至70°C，优选 30 °C 至 65 °C，更优选 37 °C 至 60 °C。3.权利要求1至2的方法，其中基质形成水凝胶。4.权利要求1至3任一项的方法，其中基质选自多糖(琼脂糖、低熔点琼脂糖、果胶、直链淀粉、琼脂、黄原胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、瓜尔胶、卡如宾糖、菊粉、葡聚糖)、蛋白质(明胶、纤维状蛋白质)、蜡和合成聚合物(聚乙烯醇、纤维素衍生物)。5.权利要求1至4任一项的方法，其中至少一种用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶选自解旋酶、嗜中温聚合酶、具有链置换活性的嗜中温聚合酶、切□酶、重组蛋白、连接酶、糖基化酶和核酸酶。6.权利要求1至5任一项的方法，其中用于核酸等温扩增的方法选自解旋酶依赖性扩增(HDA)、热稳定的HDA (tHDA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增、单引物等温扩增(SPIA)、限制性辅助RCA、转录介导的扩增(TMA)、和使用切口酶的扩增反应切口酶扩增反应(NEAR)、使用重组蛋白的扩增反应重组酶聚合酶扩增(RPA...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂安·科哈格，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：
国别省市：