一种鉴定七种海参种类的PCR-RFLP方法，它的步骤为首先提取海参DNA模板；然后对COⅠ基因的特异性片段进行PCR扩增得到690bp左右的片段；其次对扩增产物进行限制性内切酶酶切；最后对酶切产物进行电泳检测，不同海参得到不同数量和大小的条带；选用的特异性内切酶分别为：加州拟刺参：SSPⅠ；北大西洋瓜参：EcoRⅤ；仿刺参：SSPⅠ，梅花参：EcoRⅤ，海地瓜：ScaⅠ，美国肉参：PvuⅡ，靴参：EcoRⅤ、SSPⅠ。本发明专利技术方法克服了传统形态学鉴定方法存在的准确性受多种因素影响、工作量大、耗时长等缺点。采用本发明专利技术，只需要一次PCR反应、一次酶切反应和一次聚丙烯凝胶电泳，操作简便，分型时间短，特异性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种分子生物学中鉴定海參种类的方法，特别是涉及ー种鉴定七种海參品种的PCR-RFLP方法。
技术介绍
海參是我国传统的海洋食物和药物资源。由于不同种类海參的营养价值、经济价值存在较大差异，一些不法商贩常用以假乱真、以次充好等手段欺骗消费者。失去原有形态的海參更易出现造假现象。传统的海參种类鉴定方法为形态学鉴定，主要依据海參的外部形态和解剖特征外部特征包括触手的形状、疣足和管足的有无、形状及其分布特征等；解剖特征主要指海參骨片的形态和呼吸树的有无。但是，形态学鉴定有其局限性1)表型可塑性和遗传可变性容易导致不正确的鉴定；2)形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元；3)形态学鉴定受生物性别和发育阶段的限制，影响鉴定的准确性；4)工作量大，耗时长。DNA条形码技术指在生物分类学领域中用动植物的基因序列作为鉴别不同物种的“条形码”，即利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种种内的特异性和种间的多样性创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。CO I基因是位于线粒体DNA上的一段编码细胞色素c氧化酶亚基I的基因，长度约为692bp。2003年，Hebert根据线粒体基因的进化速率、突变特点将CO I基因作为条形码对动物界中共11个门的物种进行了分析，证明了 CO I基因作为DNA条形码的可行性。线粒体CO I基因具有分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、易扩增、进化速率快、多拷贝等优点，目前已经作为主要的DNA条形码广泛应用于动物的种类鉴定。已有研究将COI基因用于海參种类鉴定。Allan等人利用COI基因绘制系统进化树方法，实现海參种类的鉴定。本实验室前期研究，对COI基因进行测序，与美国国立生物技术信息中心(NCBI)中COI基因数据库比对，实现了海參种类的鉴定。但是这两种方法需经测序，并与网上数据比对，绘制进化树才能得出结论，耗时长、成本高、通量低。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种鉴定七种海參种类的PCR-RFLP方法，能克服现有技术的缺点，实现海參种类的快速鉴定，同时可对失去外部形态特征的海參酶解液进行鉴定。PCR-RFLP方法不需要测序，因此省去了 PCR产物纯化、测序时间，并节约了成本，在保证可靠性的情况下，该方法更简便、快捷。本专利技术的基本原理为用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条帯。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。本专利技术是通过以下技术方案实现的一种鉴定七种海參种类的PCR-RFLP方法，它的步骤为首先提取海參DNA模板；然后对CO I基因的特异性片段进行PCR扩增得到690bp左右的片段；其次对扩增产物用限制性内切酶酶切；最后对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，不同海參的酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到不同数量和大小的条带；所述的PCR 扩增的引物CO I ef5’-ATAATGATAGGAGG[A/G]ITTGG-3’，CO I er5’-GCTCGTGT[A/G] TCTAC [A/G]TCCAT-3，；所述的七种海參分别为加州拟刺參、北大西洋瓜參、仿刺參、梅花參、海地瓜、美国肉參和靴參；所述的限制性内切酶是SSP1、EcoRV、Sca I和Pvu II中的一种、两种、三种或全部四种。进ー步，所述的PCR扩增反应体系为50ii L，包含25mM MgCl22 u L, IOmM dNTPl u L, 两条引物各luL，反应体系中每种引物终浓度0. 2iiM，Taq DNA聚合酶5U，10 XPCRBuffer5 u L以及模板DNA200ng，余量用水补齐；进ー步,所述的PCR扩增反应參数为94°C预变性5min后经过30个循环,姆个循环包括94°C 50sec，46°C lmin，72°C lmin，最后72°C延伸lOmin。进ー步，所述的限制性内切酶酶切反应体系为30 u L，包括10 X酶切缓冲液2 u L，PCR产物10 u L，单ー酶浓度IFDU/U LO. 5 u L或多种酶每种浓度IFDU/ y L各0. 5 y L，其余用水补齐，反应时间为37°C 30min。本专利技术与现有技术相比的有益效果UPCR-RFLP鉴定海參种类，克服了传统形态学鉴定方法存在的准确性受多种因素影响、工作量大、耗时长等缺点。采用本专利技术，只需要一次PCR反应、一次酶切反应和一次聚丙烯凝胶电泳；2、该方法操作简便，分型时间短，特异性好。3、该方法可对失去外部形态特征的海參进行鉴定。附图说明图1为用每种海參对应的特异性限制性内切酶进行酶切的实验結果M-DNAMarker (DL2000) ;1_加州拟刺參；2_北大西洋瓜參；3_仿刺參；4_梅花參；5_海地瓜；6-美国肉參；7-靴參。图2为用4种酶进行酶切的实验结果M-DNA Marker (DL2000) ；1-加州拟刺參；2-靴參；3_海地瓜；4_美国肉參；5_梅花參；6_仿刺參-J-北大西洋瓜參。图3为仿刺參酶解液的鉴别结果M-DNA Marker (DL2000) ;1_仿刺參酶解液。具体实施例方式下面通过实施例来对本专利技术的技术方案做进ー步的解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。一种鉴定七种海參种类的PCR-RFLP方法，它的步骤为首先提取海參DNA模板；然后对CO I基因的特异性片段进行PCR扩增得到690bp左右的片段；其次对扩增产物进行限制性内切酶酶切实验；最后对酶切产物进行电泳检测，不同海參的酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到不同数量和大小的条带。本专利技术所用的引物对为COI ef5’ -ATAAT GATAGGAGG [A/G] ITTGG-3 ’，CO I er5，-GCTCGTGT [A/G] TCTAC [A/G] TCCAT-3，，所述的 PCR-RFLP 反应体系为 30yL，包括10 X酶切缓冲液2 ii L，PCR产物10 u L，单ー酶浓度IFDU/ U L0. 5 u L或多种酶每种浓度IFDU/ii L各0.5 iiL，其余用水补齐。IFDU指在37°C，IX缓冲液中5分钟内酶切I y g入噬菌体DNA所需的酶量，选用的特异性内切酶分别为加州拟刺參SSP I，2 (190，498);北大西洋瓜參EcoR V，2 (147，545);仿刺參SSP 1,3 (190，221，281);梅花參EcoR V，3(47，99，546);海地瓜Sca 1,2 (306，386);美国肉參Pvu 11,2 (241，451);靴參EcoR V、SSP I，3 (147，224，321)。干海參品种的鉴定(I)海參样品的预处理干海參用自来水冲洗干净，55°C蒸馏水中泡发过夜；(2) DNA模板的提取①称取IOOmg海參肌肉柱，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎或置液氮研碎。然后加入 400ii L 裂解液(50mM Tris — HCl pH7. 5 ；1. 5%CTAB ；1M NaCl ；15mMEDTA)和12iiL20mg/mL蛋白酶K，置于55°C中5_8小时直至样品溶解本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定七种海参种类的PCR?RFLP方法，其特征在于它的步骤为首先提取海参DNA模板；然后对COⅠ基因的特异性片段进行PCR扩增得到690bp左右的片段；其次对扩增产物用限制性内切酶酶切；最后对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，不同海参的酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到不同数量和大小的条带；所述的PCR扩增的引物：COⅠef5’?ATAATGATAGGAGG[A/G]TTTGG?3’，COⅠer5’?GCTCGTGT[A/G]TCTAC[A/G]TCCAT?3’；所述的七种海参分别为加州拟刺参、北大西洋瓜参、仿刺参、梅花参、海地瓜、美国肉参和靴参；所述的限制性内切酶是SSPⅠ、EcoRⅤ、ScaⅠ和PvuⅡ中的一种、两种、三种或全部四种。
【技术特征摘要】
1.一种鉴定七种海参种类的PCR-RFLP方法，其特征在于它的步骤为首先提取海参DNA模板；然后对CO I基因的特异性片段进行PCR扩增得到690bp左右的片段；其次对扩增产物用限制性内切酶酶切；最后对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，不同海参的酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到不同数量和大小的条带； 所述的 PCR 扩增的引物CO I ef5’ -ATAATGATAGGAGG[A/G]TTTGG-3’，CO I er5’-GCTCGTGT[A/G] TCTAC [A/G]TCCAT-3，； 所述的七种海参分别为加州拟刺参、北大西洋瓜参、仿刺参、梅花参、海地瓜、美国肉参和靴参； 所述的限制性内切酶是SSP I ,EcoR V,Sca I和Pvu II中的一种、两种、三种或全部四种。2.根据权利要求1所述的一种鉴定七种海参种类的PCR-RFLP方法，其特征在于所述的PCR扩增反应体系为50 μ L，...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐庆娟，郑荣，律迎春，王玉明，李兆杰，薛勇，王静凤，薛长湖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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