JAK2基因突变检测方法及其试剂盒技术

JAK2突变对骨髓增殖性肿瘤的分类和诊断具有划时代的意义，本发明专利技术针对现有技术中对JAK2突变存在检测范围小的局限，以及存在一定的漏检率的问题，提供一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的JAK2基因突变检测方法及其试剂盒，除可对患者外周血检测外，也可对添加肝素的患者骨髓标本进行检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体是JAK2基因突变检测方法及其试剂盒。
技术介绍
JAK2基因位于人9号染色体短臂，具有25个外显子。JAK2的分子结构与功能已经基本了解。James 等人(Nature. 2005 Apr 28 ；434(7037) :1144-1148.)将 JAK2 基因野生型与V617F突变型体外转染细胞株实验发现，野生型能够激活STAT介导的转录过程，而 V617F突变型无此功能。他们又进一步将转染有野生型JAK2基因和V617F突变型的细胞移植至小鼠，发现移植了 V617F突变性骨髓的小鼠能够引起血细胞异常增多。这些体内和体外实验均表明，JAK2基因V617F突变能够导致MPN的发生。JAK2突变主要发生位点在 14号外显子的V617F。(申请号/专利号200580042022)。但是，在14号外显子上除常见的V617F突变以外，还存在其它如K607N，L611V等多种类型突变(Oncogene. 2006Mar 2 ； 25(9) :1434-6. Leukemia. 2010 May ；24(5) :1069-73.)。JAK2 基因 12 号外显子突变没有突变热点，目前发现JAK2基因12号外显子突变类型及位点至少有十种以上(Blood. February 1,2008 vol.1ll no. 3 1686-1689)。以往对JAK2的突变检测仅仅针对一种突变类型或者一个突变位点(申请号/专利号200910051739 ;申请号/专利号200780021194 ;申请号/ 专利号200880006541)，因此应用基因测序(Sequence-Based Testing, SBT)技术对 JAK2 基因12、14号外显子序列进行测序，必将成为检测JAK2基因突变的发展方向。JAK2 突变对骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms, MPN)的分类和诊断具有划时代的意义。2008年，世界卫生组织(WHO)将骨髓增殖性疾病 (myeloproliferativedisorder,MPD)改名为MPN,主要包括以下9种类型,①.慢性粒细胞白血病(CML)②.真性红细胞增多症(PV)③.原发性血小板增多症(ET)④.慢性原发性骨髓纤维化(MF)⑤.慢性中性粒细胞白血病(CNL)⑥.慢性嗜酸细胞性白血病(CEL)⑦· 高嗜酸细胞综合症(HES)⑧.肥大细胞病(MCD)⑨.不能分类的骨髓增 殖性肿瘤(MPN-U)。 2008年，随着对MPD的肿瘤本质得到确认，WHO将MPD改名为MPN。MPN疾病的单病种发病率大多在1/10万以下，属于罕见疾病。近10年来，随着人们生活水平的提高及医疗条件的改善，已发现的MPN患者总数增加了三倍左右。JAK2基因在PV、ET、IMF中具有较高的突变几率。其中，PV患者JAK2突变率达到90%以上，ET、MF患者JAK2突变率有50%以上。 JAK2突变在其它MPN疾病中也存在一定的突变机率。除在体检中发现外周血异常而跟踪复查并确诊的患者外，本病的漏诊、误诊率很高。因此，JAK2基因是否存在突变对患者的诊断具有重要的意义。目前，国内只有针对某一位点如V617F突变PCR检测，以及应用探针检测的方法。 这些方法在实际应用中存在检测范围小的局限性，而且，从临床角度来讲，还存在一定的漏检率。
技术实现思路
本专利技术正是针对以上技术问题，提供一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的JAK2基因突变检测方法及其试剂盒，除可对患者外周血检测外，也可对添加肝素的患者骨髓标本进行检测。本专利技术通过以下技术方案来实现本专利技术提供一种JAK2基因突变检测方法，包括以下步骤(a)提取待检样本的DNA ；(b)分别用JAK2基因12号外显子PCR扩增引物和JAK2基因14号外显子PCR扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA从正、反两个方向进行PCR扩增；(C)分别用JAK2基因12号外显子测序反应引物和JAK2基因14号外显子测序反应引物对步骤(b)中扩增后的DNA从正、反两个方向进行测序；(d)将步骤(C)中的测序结果与标准JAK2基因12号外显子和14号外显子从正、 反两个方向进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。本专利技术根据人9号染色体基因组序列登录号NT_008413. 18设计JAK2基因12号和14号相关引物如下，JAK2基因12号外显子PCR扩增引物JAK2E12F 5/ -CAATGAGTTGACCCCTAA -3' (NT_008413. 18 :5059763-5059780)；JAK2E12R 5/ -GCTAACATCTAACACAAGG-3' (ΝΤ_008413· 18 :5060201-5060219)，JAK2基因12号外显子测序反应引物JAK2E12F2 5/ -TAGGAGTTATTAAGCATT-3' (NT_008413. 18 :5059811-5059828)；JAK2E12R2 5/ -AATTCCAATGTCACATGA-3' (ΝΤ_008413· 18 :5060123-5060140)，JAK2基因14号外显子PCR扩增引物JAK2E14F 5/ -GCATCTTTATTATGGCAGAG-3' (NT_008413. 18 :5063611-5063630)；JAK2E14R 5/ -TGGGCATTGTAACCTTCTAC-3' (ΝΤ_008413· 18 :5063981-5064000)，JAK2基因14号外显子测序反应引物JAK2E14F2 5 ' -TTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGC-3 ' (ΝΤ_008413· 18 5063690-5063711)；JAK2E14R2 5 ' -GTTTACACTGACACCTAGCTG-3 ' (ΝΤ_008413· 18 5063866-5063886)。本专利技术提供JAK2基因突变检测试剂盒，包括PCR Amplification Mixture ； Primer (12 号外显子、14 号外显子)、HotStarTaq 酶、消化酶、Sequencing Mixture (正向、 反向)本专利技术JAK2基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为每50μ1中含5μ1的10倍扩增缓冲液、2111浓度为25禮的1%2+、 2μ I浓度为IOmM的dNTPs、1.5y I浓度为10 μ M的正向引物、1. 5 μ I浓度为10 μ M的反向引物、O. 3μ I的Taq DNA聚合酶、I μ I的DNA模板、余量为HiH2O，测序反应体系为4μ I的 BigdyeV3. 1、3μ I 的 πιΗ20、1μ I 浓度为 10 μ M 的 Sequencing 引物(F，R)、2y I 的 PCR 产物。本专利技术JAK2基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为先95°C反应15min，然后94°C反应O. 5min，然后56°C反应O. 5min，然后72°C反应Imin为一个循环，共反应35个循环然后72 C反应7min,最后4 C保存。本专利技术JAK2基因突变检本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术提供JAK2基因突变检测方法，包括以下步骤：(a)提取待检样本的DNA；(b)分别用JAK2基因12号外显子PCR扩增引物和JAK2基因14号外显子PCR扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA从正、反两个方向进行PCR扩增；(c)分别用JAK2基因12号外显子测序反应引物和JAK2基因14号外显子测序反应引物对步骤(b)中扩增后的DNA从正、反两个方向进行测序；(d)将步骤(c)中的测序结果与标准JAK2基因12号外显子和14号外显子从正、反两个方向进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：费敏，沈宏杰，
申请(专利权)人：苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：