本发明专利技术提供了一种对慢性乙肝病毒(HBV)感染患者在接受核苷类似物/核酸类似物抗病毒治疗时的疗效监控和耐药危险评估的方法，这一方法在测定病毒DNA的量的同时可以鉴定耐药的突变病毒。本发明专利技术还提供了方法和试剂用来高度敏感鉴定/定量来自体液或肿瘤组织的KRas致癌基因的突变，以及这些方法用来评估患癌症危险性、早期癌症检测、治疗结果预测和治疗监测的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及人乙肝病毒的突变，人类KRas致癌基因(oncogene)的突 变以及基因突变的检测和定量的方法。本申请还涉及用于治疗监测、疾病早期检测和/或风险评估筛选以及用于预后的方法和检测试剂盒。背景乙肝病毒(HBV)的慢性感染是全球的主要健康负担之一。如果没有进行有效的干预，多达四分之一的慢性感染者在几十年的反复肝损伤后会发展为肝硬化，这些患者的一部分会发生肝癌(Liaw，Y. F.和C.M· Chu，乙肝病毒感染。Lancet, 2009, 373 (9663):第582-592 页；Liang, T. J.，乙肝病毒和疾病，Hepatology, 2009,49 (5 增刊):第 S13-21页；通过参照并入本文)。大量证据特别体现在“高病毒载量和相关的肝脏疾病风险评估”(REVEAL)研究已经表明，活跃的病毒复制，表现为血清HBV DNA水平>每毫升IO4个拷贝，在疾病进展为肝硬化和肝癌中起着至关重要的作用(Chen，C. J.等人，肝癌风险在血清乙肝病毒DNA水平梯度的分布。JAMA，2006年295 (I):第65-73页；Iloe je，U. H.，等人，血液乙肝病毒载量的水平预测肝硬化风险。Gastroenterology, 2006年130 (3) :678-86页；通过参照并入本文)。因此，目前的治疗目标是集中在抑制病毒复制(Liaw，Y. F.等人，拉米夫定治疗中YMDD变异后出现的急性发作和乙肝病毒清除。肝脏病杂志H印atology，1999年30 (2):第567-72页，通过参照并入本文)。因为在肝脏中复制的病毒颗粒被直接释放到血液中，所以检测疗效的途径是检测血液中的病毒DNA的量。在美国，已批准五个口服的抗HBV药物作为慢性乙肝的单用或联合疗法。他们是属于核苷类似物的拉米夫定、替比夫定和恩替卡韦，以及作为核苷酸类似物的阿德福韦和替诺福韦。与干扰素治疗相比，这些核苷(酸)类似物(NAs)使用方便，能有效地抑制病毒复制，并有很好的耐受性。利用NAs抑制病毒复制伴随有丙氨酸转氨酶水平转向正常，肝纤维化/肝硬化的逆转所显示的组织学改善以及HCC发病率的降低(Liaw，Y. F.等人，拉米夫定治疗慢性乙肝和晚期肝癌。新英格兰医学杂志N Engl J Med，2004年，351 (15):第1521-1531页，通过参照并入本文)。另一方面，由于病毒基因组被稳定地维持于被感染的肝细胞中并且病毒基因组不被NAs直接靶向，所以多数患者需要长期治疗(Moraleda，G.，等人，在不分裂的肝细胞培养中缺乏对土拨鼠肝炎病毒闭合环状DNA的抗病毒治疗效果。病毒学杂志J Virol，1997年71 (12):第9392-9页，通过参照并入本文)。然而，长期治疗在不同程度上与耐药病毒突变体的选择/产生有关，如果不及时启动救援治疗，其会导致急性发作或肝功能失代偿(Liaw，Y. F.，等人。拉米夫定治疗中YMDD变异后出现的急性发作和乙肝病毒清除。肝脏病杂志Hepatology, 1999年30 (2):第567-72页；Lok, A. S.等人。患者中，拉米夫定治疗慢性乙肝的长期安全性。胃肠病学Gastroenterology, 2003年125(6)第1714-1722页，通过参照并入本文)。因此，早期检测或预测耐药性在慢性乙肝的管理中非常重要，特别是在高风险的患者，如肝硬化患者中。综上所述，有效的治疗监测需要(I)测量血液中的病毒DNA的量，和(2)早期检测潜在的耐药突变体病毒。在临床上，测定病毒DNA的量是通过使用TaqMan实时PCR方法进行的，但它不能同时检测突变，而突变目前是使用DNA测序或者线性探针杂交测定方法(LIPA)进行检测的，但DNA测序或者线性探针杂交测定方法(LIPA)都不能测量病毒DNA的量。针对拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦的耐药性，都涉及在病毒逆转录酶基因的密码子204(rt204)的突变，其中，该密码子编码所谓的“YMDD基序”中的蛋氨酸(M)。基于实时PCR的检测方法可以同时测量WT病毒DNA的量和突变病毒DNA的量，以便以低成本早期检 测耐药性。这样的测定法在过去的几年已有报道(Chieochansin,T.,等人。用PCR为基础的方法快速检测拉米夫定耐药的乙肝病毒基因突变。Tohoku J Exp Med，2006年。210(1)第67-78页；Yoshida, S.等人。用变体类型特异性的TaqMan小沟粘结剂探针从慢性乙肝患者定量检测乙肝病毒拉米夫定耐药突突变。Ann Clin Biochem，2008年45 (I) 59-64 ；Shih, Y. H.等人。用实时定量PCR和退火曲线分析在一个反应中定量乙肝病毒并检测YMDD突变。抗病毒疗法杂志Antivir Ther, 2008,13 (4):第469-80页，全部引作参考)。然而这些测定法都不能可靠地检测rt204突变。这是因为病毒的基因组在不同患者之间显示出高水平的多态性(变化性)；长度为15-20个核苷酸的常规探针有可能遇到多态性，这导致定量和熔解曲线分析的错误结果。KRas致癌基因编码KRas致癌蛋白，其在促进细胞生长中发挥重要作用。KRas蛋白活性被严格控制，在特定的时间“打开”和“关闭”。如果KRas蛋白一直被“打开”，则细胞生长就会失去控制，从而引起肿瘤。KRas基因密码子12和密码子13的突变可以导致KRas蛋白的组成型(constitutive)激活，即，KRas蛋白现在被锁定在“持续打开”的状态(Yamamoto, F. and M. Perucho,人 c-K-ras 致癌基因的激活，核酸研究杂志 Nucleic AcidsRes，1984年，12 (23):第8873-85页，通过参照并入本文)。KRas基因密码子12/13突变已经被认为至少是人类癌症的致病因素之一，经常在胰腺癌、结直肠癌(CRC)和其他一些癌症中被检测到(Bos，JL，ras致癌癌基因与人类癌症综述。癌症研究Cancer Res，1989年。49(17):第4682-9页，通过参照并入本文)。肿瘤细胞死亡时，肿瘤细胞内的突变的KRas DNA可以被释放到血液循环中。因此，从血液循环检测到KRas突变有助于癌症的早期检测。监测癌症外科切除手术前后的KRas突变基因的量也将有助于发现是否有隐藏的肿瘤或肿瘤复发(Diehl，F.，等人，血液循环中的突变DNA评估肿瘤的动态。Nat Med, 2008,14 (9):第985-90页，列为参考文献)。为此必须以很高灵敏度定量KRas基因突变。结直肠癌(CRC)是美国第二常见的癌症，也是癌症死亡的第二大原因。约40-50%的CRC组织可以检测到KRas密码子12和13的突变，这些突变是肿瘤恶化和对某些化疗无响应的原因。目前常规地检测肿瘤组织中的KRas突变情况用来指导选择合适的化疗。这些方法包括DNA测序、实时PCR和高分辨率熔解分析。这些现有的方法需要突变体的量超过“总IRas基因的5%。此外，这些方法是定性的(阳性或阴性)，而不是定量的。因此这些方法不能用于早期检测或手术后的监测。此外，目前使用的实时PCR检测KRas密码子12和13突变本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：任向东，爱力克·S·任，
申请(专利权)人：润尼生命科学公司，
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