本发明专利技术提供了一种不基于GC夹板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18SrDNA片段是指包含18SrDNA远离ITS序列的末端区域的片段，以Saccharomycescerevisiae标准菌株NCYC505的18SrDNA序列为参照，所述18SrDNA远离ITS序列的末端区域相当于其起于第1到第30位点范围内任一核苷酸止于第291位点核苷酸的片段。本发明专利技术采用特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析无需GC夹板，就可以在相同条件下获得同带有GC夹板一致的结果，因此可以节约实验成本、减少实验操作步骤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，尤其是指ー种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法。
技术介绍
DGGE (变性梯度凝胶电泳)和TGGE (温度梯度凝胶电泳)是两种基于DNA片段序列差异的电泳技术，早期常用于基因突变的有效检測，目前已经成为微生物菌群多祥性研究的重要手段。采用这两项技术可以分离长度相同但序列不同的DNA片段，片段的分离是依靠双链DNA在含有化学变性剂梯度(DGGE)或者温度梯度(TGGE)的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为来实现的。为了尽可能有效地检测序列当中的所有突变，通常在目标片段的 一端加上一段30bp-50bp的高GC片段——由人工合成加在引物的5’端，则经过PCR扩增其产物末端就含有该片段；在进行DGGE或者TGGE分析吋，该高GC区域将使得目标片段在变性梯度环境中不至于完全解链，就可以实现对所有可能的单碱基突变进行检测，此即GC夹板策略。对于菌群结构研究而言，序列各种单碱基差异的有效识别，将有助于菌群多祥性的准确解析。相关研究表明，对于50_1000bp范围内的片段如果采用天然序列，DGGE只能检测所有可能的单碱基突变的50% [V. C. Sheffield, D. R. Cox, L. S. Lerman,R. M. Myers. Attachment of a 40-base-pair G + C-rich sequence (GC-ciamp) togenomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improveddetection of single-base changes [J]. Proc. Natl. Acad. ScL USA . 1989,86:232-236.];而采用GC夹板策略，则可以大大提高DGGE/TGGE的突变检出率，几乎可以检测任何可能的单喊基突变[R. M. Myers, S. G. Fischer, T. Maniatis, et al. Nearlyall single base substitutions in DNA iragnents joined to a bC-clamp can bedetected by denaturing gradient gel electrophoresis [J]. Nucleic Acids Res.1985，13 (9) :3131-3145.]，因此目前该策略已被几乎所有的DGGE或TGGE相关研究(包括菌群结构研究)所采用。然而在进行菌群结构研究吋，需要同时合成包括含有GC夹板的长引物和不含GC夹板的普通引物两套引物，尤其是含有GC夹板的长引物通常在60bp以上需要较高的成本，此外有时会出现GC长引物扩增效率降低的情況。事实上，在采用某些特定的DNA片段进行DGGE或TGGE分析吋，GC夹板的有无并不会影响到实验結果。
技术实现思路
本专利技术提供了ー种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段进行的DGGE/TGGE分析无需GC夹板，就可以获得同带有GC夹板一致的结果，可以节约实验成本、減少实验操作步骤。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案如下ー种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA远离ITS序列的末端区域的片段，以SaccharomycescereFisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列为參照,所述18S rDNA远离ITS序列的末端区域相当于其起于第I到第30位点范围内任一核苷酸止于第291位点核苷酸的片段。述DGGE/TGGE分析方法包含如下步骤 a、提取所研究样品的基因组DNA； b、扩增特定18SrDNA片段； C、将步骤b扩增获得的特定18S rDNA片段进行DGGE或TGGE分析； d、割胶回收目的条带并采用同样的引物对片段进行重新扩增；所述同样的引物即步骤 b中用于扩增特定18S rDNA片段的引物； e、对重扩增的片段进行序列測定，測定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索并根据结果判定序列所对应菌株的种属。专利技术采用特定18S rDNA片段进行DGGE分析时，变性剂梯度上限小于40%。本专利技术的显著优点本专利技术提供了ー种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段进行的DGGE/TGGE分析无需GC夹板，就可以获得同带有GC夹板一致的结果，可以节约实验成本、減少实验操作步骤。附图说明图I是18S rDNA远离ITS序列的末端区域示意图；图中只展示出18S rDNA片段及与其相邻的ITS片段，其中黒色区带部分表示的是18S rDNA片段，白色区带部分表示的是ITS片段，双箭头区域表示的是18S rDNA远离ITS序列的末端区域。图2是16种真菌的18S rDNA末端区域的序列比对图谱；图中ト16表示16种菌的编号，所代表的种属详见表I，图中NSl表不引物；图中ruler标识的1-160区域为低GC含量片段，而160-280区域含有三个高GC含量片段，分别用三个方框大致标出。引物NSl的靶向位点位于18S rDNA远离ITS序列的末端区域中。虽然收集到的各真菌的18S rDNA序列在远离ITS序列的末端起始情况不一，但至少起始于第20位点，为了分析方便，部分真菌的18S rDNA序列末端以引物NSl序列补齐，这样并不会影响到其低GC含量的序列特性。图3是引物对NSl-fung和NSl-GCfung扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱。图4是引物对NSl-fung和NSl-GCfung扩增片段的DGGE分析图谱。图5是引物对NSl-fung重扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱；重扩增模板为图4中的20条DGGE条带的割胶回收液，图中的字母代表模板在图4中的标识。具体实施例方式一、本专利技术基于特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析原理 经过对目前已知的各主要真菌种属的18S rDNA序列进行分析发现，18S rDNA远离ITS序列的末端区域(參见图I)具有特殊的序列特性其一端含有180bp左右的低GC区域，相当子 Saccharomyces cereFisiae 标准菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列(Accession Number为Z75578)的1-183位点，其平均GC含量只有35%左右，并且具有极高的可变性；紧邻低GC区域的另一端含有三个排列紧凑的高GC区域,分别相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505 的 18S rDNA序列(Accession Number 为 Z75578)的 184-202位点、223-244位点和268-291位点，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。这样就导致18SrDNA远离ITS序列的末端区域拥有低熔解区和高熔解区，并且两者之间的熔解本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种不基于GC夹板策略的特定18S?rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于：所述特定18S?rDNA片段是指包含18S?rDNA远离ITS序列的末端区域的片段，以Saccharomyces?cerevisiae标准菌株NCYC?505的18S?rDNA序列为参照，所述18S?rDNA远离ITS序列的末端区域相当于其起于第1到第30位点范围内任一核苷酸止于第291位点核苷酸的片段。
【技术特征摘要】
1.一种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA远离ITS序列的末端区域的片段，以Saccharomyces cereFisiae 标准菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列为参照,所述 18S rDNA 远离ITS序列的末端区域相当于其起于第I到第30位点范围内任一核苷酸止于第291位点核苷酸的片段。2.根据权利要求I所述的一种不基于GC夹板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于所述方法包含如下步骤 a、提取所研究样品的基因组DNA；...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪莉，黄志清，黄山，靳爽，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：
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