本发明专利技术公开了一种特异性检测植物乳杆菌的检测方法及试剂盒。该检测方法包括步骤：（1）提取基因组DNA；（2）以（1）所提取的DNA为模板，采用如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示的引物进行PCR反应；（3）对（2）得到的扩增产物进行电泳检测和结果判断。该试剂盒包括序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示的引物。该引物和方法检测植物乳杆菌的灵敏度和准确度相比现有技术有大幅度提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及特异性检测植物乳杆菌的检测方法及其试剂盒。
技术介绍
乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同且能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌。人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有久远的历史，并积累了丰富的经验和知识，形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法，包括形态特征、生理生化反应及血清学反应等，这些方法都是基于微生物表面受体的特异性，属于表型分类法。 随着科技的进步，分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，并已成功介入到益生菌的鉴定领域。16S rDNA序列同源性分析作为细菌系统发育和亲缘关系研究已被普遍接受和广泛应用，但是乳杆菌属内许多种的16S rDNA基因序列具有较高同源性，利用该方法无法使鉴定精确到种。例如，16S rDNA基因序列分析法不能将相近的植物乳杆菌与戊糖乳杆菌区分开。伴随着高通量测序技术的快速发展，大量乳酸菌菌株的基因组图谱已被解析。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为不同种乳酸菌的区分和鉴定奠定了基础。
技术实现思路
因此，本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的检测方法难以将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)鉴定到种的水平的缺陷，而根据现有的已测序的乳酸菌基因组信息并运用生物信息学的方法设计植物乳杆菌的种特异性引物，运用多重PCR的方法与电泳图谱分析来确定菌种特征性片段的存在有无，从而对植物乳杆菌进行特异性快速检测。本专利技术提供的技术方案之一是一种特异性检测植物乳杆菌的方法，其包括如下步骤(I)提取待测样品的基因组DNA ；(2)以步骤(I)所提取的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示的引物进行多重PCR反应，以扩增特征性片段；(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行电泳检测并进行结果判断。本专利技术中，步骤(I)所述的提取基因组DNA的方法为本领域常规的提取微生物基因组的方法，如碱裂解法或者利用市售的基因组DNA提取试剂盒提取。本专利技术中，步骤(2)所述多重PCR反应的反应体系为本领域常规；较佳地，反应体系中包括浓度各为O. 2 O. 5 μ mol/L的序列分别如SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示的引物，O. I O. 3mmol/L 的 dNTP,I X PCR 缓冲液，O. 5 I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05 O. 15U/y L 的 Taq DNA 聚合酶和 I. O 2.Ong/yL的DNA模板；更佳地，所述多重PCR反应的反应体系中包括浓度各为O. 4μπιο1/L 的序列分别如 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6 所示的引物，O. 2_01/1的(1见13，1\ 0 缓冲液，ImmoI/L 的 Mg2+，O. 05U/μ L 的Taq DNA聚合酶和2. Ong/ μ L的DNA模板；所述多重PCR反应的反应体系的总体积较佳地为20 50 μ L，更佳地为25 μ L0本专利技术中，步骤(2)所述多重PCR反应的反应程序为本领域常规，只要能够扩增出植物乳杆菌特异性的基因片段即可；较佳地，所述多重PCR反应的反应程序为①94 95°C，4 5min ,② 94 95°C，30 40s 55 57°C，30 50s 71 73°C，15 60s ；步骤②至④共20 30个循环； 71 73°C，8 IOmin 3 5°C保存；更佳地，所述多重PCR反应的反应程序为①95°C，5min ■级95°C，40s ;③55°C，30s 72°C，30s ;步骤② 至④共25个循环； 72°C，8min ; 4°C保存。本专利技术中，步骤(3 )所述的电泳为本领域常规，如琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，较佳的是琼脂糖凝胶电泳，更佳的是I 3%的琼脂糖凝胶电泳，最佳的是2%的琼脂糖凝胶电泳。本专利技术中，步骤(3)所述结果判断的方法为本领域常规的方法，即将电泳产物在一定条件下成像，即可判断结果。较佳地，所述结果判断的方法为在紫外凝胶成像仪下拍照成像，采用序列如 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6所示引物的PCR反应产物，若同时存在lOlbp，189bp和378bp的核酸片段，则说明待测样品中存在植物乳杆菌；若不同时存在lOlbp，189bp和378bp的核酸片段，则说明待测样品中不存在植物乳杆菌。与本领域常规一样，可与对照DNA标准品比较而得DNA片段的长度。本专利技术提供的技术方案之二是一种用于特异性检测植物乳杆菌的试剂盒，其包括如前所述的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示的引物。本专利技术中，所述的试剂盒较佳地还包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+和TaqDNA聚合酶中的一种或多种。本专利技术中，所述的试剂盒较佳地还包括阳性对照和/或基因抽提试剂。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于本专利技术所提供的特异性检测植物乳杆菌的引物仅能扩增出植物乳杆菌种内的各个亚种及种内各株系的特异性片段，而对其他近缘菌株特别是戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和副植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)等在常规检测手段中干扰性较强的菌株均无相应扩增。运用本专利技术所述的多重PCR反应进行种间特异性扩增，并依据琼脂糖凝胶电泳图谱分析，能够简便、快速、准确地定性检测产品中是否含有植物乳杆菌，其灵敏度和准确度相比现有的检测技术有大幅度提高，检出限可达 2. 2X102cfu/mL。附图说明图I为实施例I中植物乳杆菌的引物特异性验证图,其中M为500bpMarker ;第I泳道为L. plantarum ATCC14917，作为阳性对照；第2泳道为H2O,作为阴性对照；第3泳道为 L. plantaruml. 2437 ;第 4 泳道为 L. plantarum WCFSl ;第 5 泳道为 L. plantarum P8 ;第 6泳道为 L. plantarum C5 ;第 7 泳道为 L. pentosus ATCC8041 ;第 8 泳道为 L. paraplantarumATCC700211 ’本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性检测植物乳杆菌（Lactobacillus?plantarum）的方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）提取待测样品的基因组DNA；（2）以步骤（1）所提取的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示的引物进行多重PCR反应，以扩增特征性片段；（3）对步骤（2）得到的扩增产物进行电泳检测并进行结果判断。
【技术特征摘要】
1.一种特异性检测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的方法,其特征在于,其包括如下步骤 (1)提取待测样品的基因组DNA； (2)以步骤(I)所提取的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQID NO. USEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示的引物进行多重PCR反应，以扩增特征性片段； (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行电泳检测并进行结果判断。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述多重PCR反应的反应体系中包括浓度各为 O. 2 O. 5 μ mol/L 的序列分别如 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ IDN0. 6 所示的引物，O. I O. 3mmol/L 的 dNTP’lXPCI^lW液，O. 5 I. 5mmol/L 的 Mg2+，O. 05 O. 15U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶和 I. O 2. Ong/ μ L 的DNA模板。3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述多重PCR反应的反应体系中包括浓度各为 O. 4 μ mol/L 的序列分别如 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ IDNO. 4,SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示的引物，O. 2mmol/L 的 dNTP，I XPCR 缓冲液，Immol/L 的 Mg2+，O. 05U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶，2. Ong/ μ L 的 DNA 模板。4.如权利要求I所...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈臣，任婧，周方方，艾连中，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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