本发明专利技术涉及一种用于检测Lactobacillus?casei?Zhang（CGMCC?1697）的检测方法的设计，应用该方法可以对样品中的Lactobacillus?casei?Zhang（CGMCC?1697）进行检测，可准确，快速的完成发酵乳制品，发酵食品以及人体肠道中益生菌Lactobacillus?casei?Zhang（CGMCC?1697）定性和定量测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)的检测方法的设计，应用该方法可以对肠道中的Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)进行检测，可准确，快速的完成发酵乳制品，发酵食品以及人体肠道中益生菌Lactobacillus caseiZhang (CGMCC 1697)定性和定量测定。
技术介绍
Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)是从内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的243株分离自自然发酵酸马奶中的乳杆菌中优选的I株具有优良益生特性的乳杆菌。该菌株在消化系统中具有优异的耐受胃酸、胆盐和牛磺胆酸钠水解能力。其具有乳杆菌共同的特性，即为革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、不液化明胶、无运动性、能在PH4. 5的BLB液体培养基中生长发育。L. casei ZhangCCGMCC 1697)属同型乳酸发酵乳杆菌，葡萄糖发酵不产气，经EMP途径只产生乳酸，且产生L-乳酸。能够利用核糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖、山梨醇以及七叶苷、水杨苷和甘露醇产酸，而不从阿拉伯糖、木糖、蜜二糖、棉子糖产酸，不代谢乳糖或弱发酵乳糖，不发酵鼠李糖。Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)菌株已经在申请号为 200610127362. 2、200710129939. 8的中国专利申请中公开，在此将上述专利文献公开的全部内容引入作为参考。进一步经16S rDNA 序列分析,表明 L. casei Zhang (CGMCC 1697)与 L. casei 标准菌株ATCC 334的同源性为100%。L. casei Zhang (CGMCC 1697)具有较强的抗人工胃液消化能力，在pH值为3. 0和PH值为4. 0的人工胃液中持续消化3h后其活菌数量不受影响，人工胃液消化后进入人工肠液消化24h后，仍保持较高数量的活菌。L. casei Zhang (CGMCC 1697)对胆盐具有极强的耐受性，能够耐受介质中胆盐的最大浓度为I. 6g/100mL。L. casei Zhang (CGMCC 1697)在生长过程中可以分解培养介质中的牛磺胆酸钠释放出游离胆酸，对介质中胆固醇的脱除量为74. 41mg/L，胆固醇降低率为49. 61%。用L. casei Zhang (CGMCC 1697)饲喂高脂血症模型大鼠，可显著降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C浓度，HDL-C浓度显著升高。研究表明L. casei Zhang (CGMCC 1697)通过菌体对胆固醇的吸收吸附及减少肝肠循环中的胆酸来达到降血脂的功效。给小鼠灌服L. casei Zhang (CGMCC 1697), L. casei Zhang (CGMCC 1697)菌株能够在小鼠肠道内定殖，并对病原菌具有拮抗作用。小鼠灌服L. casei Zhang (CGMCC 1697)可以显著增加小鼠血清中IgG含量和肠粘膜SIgA含量，可以显著提高小鼠外周血中⑶3+、⑶4+、⑶8+的比例，优化了⑶4+/⑶8+比值，显著上调血清中IFN-Y和IL-12含量，下调IL-Ia和TNF-a水平。这些结果说明了 L. casei Zhang (CGMCC 1697)对小鼠的细胞免疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫具有调节功能。动物实验表明L. casei ZhangCCGMCC 1697)具有显著抑制肝癌细胞H22细胞株具有显著的抑制作用。2007年，通过代谢调控的手段，完成了益生乳酸菌L. casei Zhang (CGMCC 1697)高密度发酵的小试和中试。200L发酵罐9次发酵发酵液中菌体密度平均可达2. 9X IOltlCfu/ml，发酵液经离心收集菌体后冷冻干燥可得到平均活菌数2. 65X10ncfu/g的菌粉，能够满足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求，已达到国际水平。为进一步研究L. casei Zhang (CGMCC 1697)在高密度发酵过程中的生长和代谢机制，采用荧光定量PCR (quantitative PCR, q-PCR)技术研究了发酵过程中一些关键基因的表达变化。分别于不同生长阶段和不同发酵条件下采集25组样品提取RNA，对涉及糖代谢和酸耐受能力的16个关键酶基因进行real-time PCR实验分析，包括葡萄糖激酶(gk), ￠-葡萄糖苷PTS E II (pts),磷酸-丝氨酸结合蛋白磷酸化酶(psh-p),代谢调节蛋白CcpA(ccpa),磷酸果糖激酶(pfk),果糖二磷酸醒缩酶(pba),磷酸甘油酸激酶(pgk),烯醇化酶(enolase),丙酮酸激酶(pk),乳酸脱氢酶(ldh), NAD依赖型醇脱氢酶(nad)、 FlFO-ATPase (atp), Malolactic enzyme (mal), citrate lyase (cit);大分子修复蛋白基因Gr0el，dnak。这些关键酶基因在发酵过程中的表达变化情况的研究为后续从分子水平深入研究乳酸菌的生长代谢调控机制奠定了良好的基础。同时也为乳酸菌高密度发酵剂的开发奠定了理论基础。10年前，当人类基因组计划顺利完成时，整个科学界都为之轰动一“生命密码”已经被破译，人类对自己的认识将愈发深刻。当科学家以为人类所有问题都将迎刃而解的时候，更多的事实却悄悄的指向了一个被我们忽视的领域——肠道菌群。正常的人体内存在大量的共生菌群，这些细菌大部分寄生在人的肠道中，超过1000万亿个，是人体细胞总数的10倍，其微生物基因数量约为300万个，大约是人类基因组基因数量的100多倍，如此海量的基因能够帮助微生物适应多变的环境，同时形成了与人体密不可分的互惠共生关系。经研究发现，肠道菌群的组成影响着每个人的健康，如肠道菌群结构紊乱与糖尿病、月巴胖症、高血压等代谢类疾病有关。同时也发现不同的人具有不同的肠道菌群组成结构，饮食、药物以及环境因素可以影响个体肠道菌群的组成。同样，不同肠道微生物结构和组成，也影响着宿主的营养物质加工、能量平衡、免疫功能、胃肠道发育及其他多种重要的生理活动。但是随着研究的深入，服用益生菌后，益生菌在体内的定植研究成为难点，怎样锚定目的菌种，怎样对目的菌种进行定量研究从而确定其体内定植数量是学者一直探索的问题。传统肠道菌群的研究是建立在纯培养技术之上的，但这些方法耗时费力，操作复杂，而且受到培养条件约束，并不能全面客观的反映肠道菌群的真实情况。分子生物学技术的飞速发展为肠道菌群研的究提供了全新的方法和思维，特别是荧光定量PCR技术(Q-PCR)，提供了基于非培养的微生物定性定量研究技术。本专利技术以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因组序列中一段特异性片段为依据，设计了针对该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株进行PCR扩增和Q-PCR定量，可以快速准确的完成L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定性定量研究。采用本专利技术的PCR和Q-PCR方法，能够对检测样品，例如包含益生菌的乳制品或食物、人体的消化道排泄物中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定性定量检测L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的方法，包括如下步骤：（1）从检测样品中提取DNA,制备用于进一步扩增的模板DNA；（2）PCR扩增，以L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的全基因组序列为依据，设计如下引物序列：LcZ?F:tgagccgctatctgatagtctt；LcZ?R:ccgacgtaccagctcact，利用设计的引物通过PCR扩增模板DNA；（3）通过琼脂糖凝胶电泳来检测PCR扩增产物，定性检测样品中的L.casei?Zhang（CGMCC?1697）；（4）通过q?PCR检测样品中L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的数量。
【技术特征摘要】
1.一种定性定量检测L. casei ZhangCCGMCC 1697)的方法，包括如下步骤(I)从检测样品中提取DNA，制备用于进一步扩增的模板DNA ；(2)PCR扩增，以L. casei Zhang (CGMCC1697)的全基因组序列为依据，设计如下引物序列LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ；LcZR:ccgacgtaccagctcact,利用设计的引物通过PCR扩增模板DNA ； (3)通过琼脂糖凝胶电泳来检测PCR扩增产物，定性检测样品中的L. casei Zhang (CGMCC 1697)； (4)通过q-PCR检测样品中 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的数量。2.权利要求I所述的一种定性定量检测L.casei ZhangCCGMCC 1697)的方法，其特征在于，包括如下步骤 (O从检测样品中提取DNA，制备用于进一步扩增的模板DNA 采用液氮冻融-CTAB法取I. Og样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I. 5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化5min，反复冻融3次，加O. ImL 10%SDS和10. O μ L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心IOmin,收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000g离心IOmin,吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经O. I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用； (2)PCR 扩增 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的特异性片段 扩增引物具体序列为；LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ;LcZ R:ccgacgtaccagctcact; 扩增体系 反应体系 50μ L :10XPCR Buffer 5μ L,25mmol/L Mg2+ I. O μ L，2· 5mmol/L dN...
【专利技术属性】
技术研发人员：张和平，张家超，陈永福，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：
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