本发明专利技术公开一种用于快速基因型鉴定的方法和装置，在一个实施例中，本发明专利技术被应用到人乳头状瘤病毒（HPV）的基因型鉴定，包括使用病毒基因型特异性寡核苷酸探针、反向斑点杂交基因型点阵方式和导流杂交过程，从而提供一种更高效、更快速和更经济的方法进行HPV基因型鉴定。这种基因型鉴定的方法可以兼容通用探针，从而扩大了HPV基因型的检测范围。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人乳头状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置本申请要求2010年4月29日提交的美国专利申请序号12/770034的优先权，该申请是部份接续2006年4月4日提交的美国专利申请序号11/398433，而后者是部分接续 2002年11月7日提交的美国专利申请序号10/291168，同时该申请声明要求2001年11月 7日提交的美国专利申请序号60/345948的权益。美国专利申请序号11/398433也是部分延续2002年11月9号提交的美国专利申请序号10/293248。前述申请内容特此全文并入本申请中作为参考。
本专利技术是关于鉴定人乳头状瘤病毒的多种基因型。
技术介绍
鉴定人类白细胞抗原(HLA)在器官或骨髓移植中，通过准确的HLA分型使得供体和受体相匹配(4)，是预防急性移植物抗宿主病(GVHD)发生的关键。HLA分型通常是通过标准血清学分型(2)来完成。最近的研究表明，DNA分型提供的结果更加准确和肯定(7，9，8)。将HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP 分型检测结果用于高精度匹配，这已是选择潜在器官捐献者的必备途径(3)。先前已有报道，利用序列特异性引物的聚合酶链反应(SSP-PCR)扩增，可进行HLA基因分型。然而，由于 HLA-DQ、DR和DP位点的高度多态性，所需序列特异性引物(SSP)的数目将会多达数百个， 超出了多重PCR扩增极限，从而无法进行有效的PCR扩增。要确保HLA基因分型的结果在临床上有实际应用，必须设置多项检测，每项各有50至100个独立的PCR反应。如今市场上提供一种试剂盒，其中包括一个扩增过程，需要进行96个独立的PCR反应，然后对凝胶电泳分离得到的片段大小进行分析。这不仅耗费时间和金钱，而且非常容易出现差错，因为反应设置复杂，另外判断凝胶电泳中片段大小也存在不确定性。因此，DNA测序仍然被认为是 HLA基因准确分型的首选方法。遗憾的是，由于在序列上高度同源，假基因也可以在聚合酶链反应(PCR)中被共同扩增，使得单独通过DNA测序进行高分辨HLA基因分型将会更加困难并且昂贵。授予JWO Tam先生的美国专利第5471547和6020187号，公开了一种可以在费用低廉的设备上进行的快速退火过程，用于准确的突变型检测、基因分型和指纹图谱分析。 本专利技术公开了一种使用改进的导流方式，利用ASO寡核苷酸探针对HLA基因座DP、DR和DQ beta序列进行快速分析的方法。DNA指纹图谱快速鉴定人类和生物体1985年，基于限制性片段长度多态性(RFLP)的DNA指纹图谱首次应用于人类身份鉴定(12)，并随后开始应用于其他生物体的鉴定。在实际应用中，DNA指纹技术作为最好的法医学工具已经被广泛接受，可用于在刑事案件中确定犯罪嫌疑人、亲子纠纷、建立或证实一个人的身份。耗时的RFLP方法已逐渐被高通量的自动化过程取代。目前，利用PCR 扩增，分析人类基因组10、16、18或更多位点上的短串联重复序列(STR)的数目(1991年发现(11))，已经实现了单细胞水平的鉴定。但是，不论STR还是可变数目的串联重复序列3(VNTR)，都相对昂贵，因为这些方法需要使用复杂的设备，以及人工密集并且过程耗时的方法，比如Southern印迹杂交。自发突变(10)也可能会降低准确性和最终鉴定结果的确定性。此外，STR数据表明，突变的频率，特别是在癌症患者中，并不鲜见。因此，需要找到新的替代方法。单核苷酸多态性(SNP)基因型鉴定是在法医或个人身份识别中一种分辨率更高的方法，这种方法基于在不连锁位点上选择一定数量的SNP位点，其中每个位点的突变频率均低于VNTR或STR系统。本专利技术展示了一种利用SNP基因型鉴定的方法，快速、明确鉴定个体生物特征，包括人、动物、植物或其他生物。HPV基因型鉴定人乳头状瘤病毒(HPV)攻击粘膜细胞，具有高度多样性，世界范围内已报道的有大约200种不同的基因型，在不同种群中患病率各不相同。根据导致疾病的严重程度，人乳头状瘤病毒分为高风险株(HR)和低风险株(LR)。HR类型较常出现在宫颈的癌前病变或恶性病变，而LR类型多为良性病例(4)。每年有大约50万宫颈癌新发病例，死亡病例预计超过 25万。因此，HPV感染与宫颈癌仍然是威胁全球女性的主要癌症(5)。基于这个原因，HPV 筛查建议用于预防宫颈癌，因为它比细胞学方法更敏感(6，7)。临床研究显示，99. 7%的子宫颈癌与HR-HPV感染有关。尽管在大多数感染病例中，HPV可能会被清除，但是持续的HR-HPV感染，会导致重度宫颈上皮内瘤样病变(如 CIN IXIN II或CIN III)，并发展成为子宫颈癌(7，8)。因此，针对HPV病毒DNA的分析方法，已被开发并推向市场。美国食品药品监督局已经批准了 Hybrid capture 2 (HC2)系统 (Digene公司，美国马里兰州Gaithersburg)和AMPLICOR HPV测试(罗氏分子诊断，美国新泽西州Branchburg)。这些筛查测试确定的是常见的HPV (HR株或LR株)是否存在，而无法区分其基因型。虽然这些测试提供了良好的HPV筛查检测，但是无法进行HPV的基因型鉴定限制了它们在临床诊断和预后中的应用，因为不同毒株引起疾病的严重程度有很大的不同，其中16型导致病症最为严重，紧随其后的是18型、33型、45型和59型等(8)。此外持续感染相同基因型的HPV，将进一步增加子宫颈癌的风险(9)。因此，有效和费用可接受的HPV基因型鉴定检测方法是最需要的。LINEAR ARRAY HPV基因型检测(罗氏分子诊断，美国新泽西州Branchburg，涵盖37 种基因型)和INNO-LIPA HPV基因型鉴定(Innogenetics公司，比利时，涵盖28种基因型)， 可以作为HC2或AMPLICOR HPV测试的补充，用于区分特定HPV基因型，并确定涉及多个HPV 基因型的感染。基于下列事实1)不同HR-HPV毒株的致癌性不同；2)相同基因型的持续性感染导致风险升高；3)已有的HPV疫苗不能防止所有类型的HPV感染，除了确定HPV病毒存在与否的常规筛查，HPV基因型鉴定仍然是需要的。然而，上述测试非常昂贵，并且仍然使用传统的杂交过程，需要较高的运行成本和人工操作时间。最重要的是，这些基因型鉴定试剂盒不能检测超出预先设定的基因型谱，因此在HPV筛查中产生较高的假阳性率。因此， HPV基因型检测方法需要实现更快捷、更便宜、覆盖更多的基因型，并因此更高效，作为目前 HPV检测的可负担的替代方法。专利技术概要HLA基因型鉴定初步结果表明，在检测特定目标HLA的DNA序列时，等位基因特异性寡核苷酸反相斑点印迹(ASO-RDB)导流杂交是一种更好的选择。由其获得的数据代表HLA-DP、DR和DQ beta位点上的特征片段，因而能够准确地鉴定基因型。使用一对PCR引物和35个ASO寡核苷酸探针，可以将世界卫生组织(WHO)确定的83个DPBl等位基因进行有效的分类。同样，使用一对相同的PCR引物和18个ASO寡核苷酸探针，这个简单的杂交方法可以识别DR 和DQ beta位点特定基因型的头两位编码，足以区分这些主要人类白细胞抗原。ASO数据通过直接测序法进行验证。但是，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭约瑟夫荣安，周约瑟夫，陈里斯卓宇，
申请(专利权)人：达雅高生物科技有限公司，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。