本发明专利技术公开了一种预防和治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染类疾病的化合物的筛选方法，该方法采用基于结构的计算机辅助药物设计，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制E1的候选化合物；上述筛选方法具有方便、省时、高效的安捷伦液质分析培训特点；本发明专利技术还公开了利用上述筛选方法得到的化合物，如曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物，这些人乳头瘤病毒E1解旋酶的抑制剂具有特异性高、针对性强的特点，有助于预防和治疗人乳头状瘤病毒感染，以及和HPV感染有关的疾病，如子宫颈癌和生殖器疣等疾病。
【技术实现步骤摘要】
预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法
本专利技术涉及治疗和预防人乳头瘤病毒感染和子宫颈癌相关的领域，尤其在设计和使用的E1解旋酶抑制剂，以预防或治疗HPV相关宫颈癌和其他疾病。
技术介绍
子宫颈癌(CervicalCancer)是世界范围内仅次于乳腺癌的威胁妇女生命健康的第二号杀手(国际卫生组织资料)，每年造成约超过30万成年女性因患子宫颈癌而死亡。目前已证实导致宫颈癌的病因是人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，简称HPV)的DNA致癌病毒的侵染所致。该病毒主要通过两性接触传染，专性侵染人体上皮细胞特别是生殖器官，部分病毒携带者在反复感染后表现出多种临床症状。女性受高危险型(HPV16、HPV18等)病毒感染后，小部分患者由最初的宫颈细胞学异常，发展成I-III的宫颈内皮细胞瘤样变(CINI-III)和浸润性宫颈癌变(ICC)，最终发展成致命的子宫颈癌。HPV病毒在长期的进化中形成了上百种变异类型，其中HPV16、HPV18等13种高危险类型，已被确认能够导致宫颈癌症。部分低危险型(HPV6、HPV11等)病毒感染可导致男女两性生殖器官部位的尖锐湿疣。HPV除了直接导致宫颈癌，新的研究资料也提供了证据，HPV的感染很可能和支气管肺癌、直肠癌、口腔癌和皮肤癌等癌症有着紧密的关系。根据国际卫生组织WHO的有关资料，除了导致宫颈癌，HPV感染还可能和60％的皮肤癌，60％的食管癌，50％的肺癌、50％的乳腺癌、25％的口腔癌等人类重大癌症的发病相关。目前国内外还没有任何有效的预防和治疗人乳头瘤病毒的化合物，主要是由于很难通过常规的手段(如普遍撒网的高通量筛选等)找到针对改该病毒的具有高特异性高的抑制剂化合物。而由于我们对人乳头瘤病毒侵染毒繁殖所必须的解旋酶的分子结构和分子机理的掌握和了解，我们可以通过对分子结构进行计算机的模拟和分析，并通过以结构为基础的分子对接用计算机对大分子库进行有效的筛选，从而能从几十万到上百万的分子库中很快的选出能结合目标蛋白的少数的化合物，从而通过试验筛选很快验证和确定具有对目标蛋白具有高特异性的抑制功能的化合物。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的上述缺陷，提出一种方便、省时、高效的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，并提供了通过上述筛选方法筛选出来的特异性高、针对性强的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，由其指出了其在预防和治疗HPV感染、子宫颈癌及尖锐湿疣等疾病上的应用。实现上述目的的技术方案如下：一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，采用基于结构的计算机辅助药物设计方法，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制E1的候选化合物。进一步地，所述的以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础包括：(a)一个由原子坐标确定下来的E1蛋白分子结构和由E1形成的六聚体的结构；(b)一个由原子坐标确定下来的E1蛋白分子与ATP或ADP相结合的复合体结构；(c)一个E1蛋白单独的结构或与一个化合物或多肽结合的复合体结构。进一步地，上述筛选方法还包括E1解旋酶功能检测，所述E1解旋酶功能检测方法采用电泳迁移率试验。本专利技术还提供了利用上述筛选方法得到的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，所述化合物为曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物。进一步地，本专利技术所述的人乳头瘤病毒感染类疾病包括子宫颈癌或尖锐湿疣。即本专利技术主要是使用乳头瘤病毒E1解旋酶的三维分子结构，来设计和筛选特异性的E1抑制剂，用作治疗和预防HPV感染及相关的宫颈癌和尖锐湿疣的药物。本专利技术所述阐明了一个通过结构和计算分析设计，以及试验筛选的方法来找到针对E1分子靶点的有效抑制剂化合物。这些化合物结合在E1分子空间结构的不同的点，用于破坏E1自身的功能，阻断E1与DNA，与三磷酸腺苷，以及与E2的相互作用，所有这些都是E1对病毒基因组复制必不可少的功能。本专利技术提供了对抑制E1功能的抗HPV病毒分子药物的设计，筛选，识别和检测的方法，同时还提供对这类抑制剂化合物在预防和治疗病毒感染和癌症(包括但不限于在HPV感染和宫颈癌和尖锐湿疣上使用这些化合物)中的应用。本专利技术主要是基于以下原理进行相关化合物筛选的：HPV是DNA病毒，病毒的基因是DNA。病毒进入人体上皮细胞后，其DNA基因必须在细胞内复制，才能完成病毒的繁殖和侵染，而病毒DNA基因的复制必须要HPV病毒的解旋酶，即E1蛋白，来打开病毒DNA双链。同时，HPVE1和HPVE2蛋白的结合和相互作用也对病毒DNA的复制启动有着关键的作用，因而，HPVE1和HPVE2也称DNA复制启动子。上述HPVE1蛋白的功能为；ATP酶和DNA解旋酶；以六倍复合体的形式识别并结合在DNA复制的病毒起源点；它是病毒DNA复制所必需的。HPVE2蛋白的功能为：病毒基因转录的主要调节因子；以二聚物的形式与病毒转录引物结合；参与病毒DNA复制过程；与E1相互作用并使E1补充到病毒复制起源点。人乳头瘤病毒的复制，需要有几个不同的生物活性环节，包括由病毒的DNA解旋酶E1把病毒的DNA双链打开，并以此作为复制模板由细胞的聚合酶启动DNA复制引物。E1解旋酶的突变或E1酶的抑制化合物可导致病毒DNA复制失败，阻断病毒的复制，以达到预防和抑制HPV病毒的侵染，从而预防和治疗子宫颈癌的效果。人乳头瘤病毒E1解旋酶和人体细胞的解旋酶(称MCM)几乎没有氨基酸序列的保守性，MCM解旋酶是人体细胞染色体复制所需的酶。HPVE1和MCM在立体结构上有着根本的不同(Brewsteretal，PNAS，2008)。由于E1的解旋酶对HPV病毒的复制是必不可少的，而E1和MCM解旋酶的序列和结构都不同，这样，E1解旋酶提供了一个极好的特异性很高的防病毒的药物靶点。因为E1是针对病毒的高特异性分子靶标，针对E1的药物可以有助于降低对人体细胞的毒性。由于解析出了HPVE1蛋白分子的晶体结构，我们能够通过分子结构的分析和建立分子结构模型来设计和开发E1酶的有效的抑制剂作为抗病毒和抗子宫癌的小分子药物。这些E1酶的有效小分子抑制剂同时也可作为分子工具，用来进一步研究解旋酶的功能和调控机制。到目前为止，尚无任何有效的药物来抑制人乳头状瘤HPV病毒的复制，侵染和繁殖。针对人乳头状瘤病毒E1解旋酶的小分子药物，是一种全新的抑制HPV病毒复制的有效药物。根据在此显示的E1和核苷酸ATP和ADP)复合体的原子结构模型，我们能够通过对结构模型的详细的计算分析，来帮助我们设计E1解旋酶的小分子抑制剂，以便达到对E1本身活性的抑制，或对E1与DNA或与E2或其它DNA复制蛋白的相互结合的抑制，从而能有效地抑制HPV病毒的复制，可用于治疗HPV感染以及相关的子宫颈癌和尖锐湿疣等疾病。下面对本专利技术中涉及的基于结构的计算机辅助药物设计的结构基础-人乳头瘤病毒E1解旋酶结构作进一步的介绍：本专利技术所指的人乳头状瘤病毒(HPV)E1蛋白是指包含50个或更多氨基酸的E1多肽序列，或更长的E1，包括全长E1蛋白，E1本身，或作为E1融合蛋白。一个同源蛋白的蛋白质，包括不是天然出现的蛋白质，并且有一个或几个氨基酸，但不局限于一个或几个氨基酸的不同或被删除(例如，蛋白质截断的片本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，其特征在于，采用结构计算机辅助药物设计方法，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制E1的候选化合物。
【技术特征摘要】
1.一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物曲伐沙星、加替沙星的筛选方法，其特征在于该方法为：采用结构计算机辅助药物设计方法，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，所述人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为：一个由原子坐标确定下来的E1蛋白分子结构和由E1形成的六聚体的结构；所述结构计算机辅助药物设计方法为：1)E1蛋白结晶：牛乳头瘤病毒E1蛋白结晶是用20mg/ml的蛋白浓度，在含有pH7.5100mMMES，pH7.5300mMKPO4，190mMNaCl，8％PEG6K的溶液里，用悬滴气相扩散法，在18度的条件下进行；2)结晶的晶包常数为：p212121，a＝133.211，b＝179.192，和c＝185.350，α＝β＝g＝90；晶体衍射分辨率为3.1埃；3)E1的六聚体的总体结构如图5(A、B)所示，E1亚基组装成有一中央通道的同源六聚结构；从侧面看，六聚体环显示为两个不同直径的环，即在顶部小环和底部大环；这两个层次的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈小江，陈林，李大伟，楼慧强，
申请(专利权)人：小江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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