本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及利用分子生物学技术手段改造纤维素酶潜在的糖基化位点，获得可以在毕赤氏酵母中高活性表达的纤维素酶突变体。经重组毕赤氏酵母表达后，外切纤维素酶突变体N64S?Cel7A的酶活比rCel7A高近7倍。本发明专利技术为构建可有效地应用于生产，且高活性表达纤维素酶的重组酵母菌，提供一个新的方法和技术材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及对外切纤维素酶Cel7A进行定点突 变，改变其糖基化的潜在位点，以提高毕赤氏酵母表达的外切纤维素酶的酶活。
技术介绍
外切纤维素酶Cel7A在瑞氏木霉(Trichoderma reesei)分泌的纤维素酶中约占 60%左右，对纤维素的水解起着重要作用，它由⑶，CBD和linker区组成。尽管Cel7A⑶区 具有四个潜在的N-糖基化位点05，64，270和384位的氨基酸)，但瑞氏木霉分泌的纤维 素酶糖基化程度并不高，糖含量仅占Cel7A分子量的14%。然而当纤维素酶在毕赤氏酵母 (Pichiapastoris)中异源表达时，酶被高度糖基化，且重组酶的活性和表达量大幅度下降。 Godbole等分析认为在两种宿主中糖基化程度不同可能是造成Cel7A在酵母中表达后酶活 低的主要原因。基于上述分析，我们有必要对Cel7A的糖基化位点进行改造，以提高毕赤氏 酵母表达的外切纤维素酶的酶活。
技术实现思路
本专利技术旨在通过分子生物学技术，定点突变外切纤维素酶Cel7A的糖基化位点， 获得可以在毕赤氏酵母中表达并具备高酶活的突变体纤维素酶。本专利技术所述的一个适于毕赤氏酵母高活性表达的外切纤维素酶突变体如下(1)糖基化位点的定点突变利用分子生物学的手段，使用点突变试剂盒 GeneEditor invitro Site-Directed Mutagenesis System(Promega 公司)等方法，将 Cel7A第64位的天冬酰胺(Asn)突变为其它氨基酸(丝氨酸，kr ；甘氨酸，Gly等)，包括 该位点单一位点突变，包含该位点突变的多位点(45，270和384位的氨基酸)组合突变等。(2)毕赤氏酵母表达纤维素酶选择毕赤酵母常用的表达载体(如pPIC9K， invitrogene公司)，连接纤维素酶或者纤维素酶突变体基因，以在毕赤氏酵母中表达纤维 素酶。本专利技术依据真菌表达蛋白质的糖基化特点，针对瑞氏木霉产外切纤维素酶Cel7A 的糖基化特征，利用分子生物学技术手段改造纤维素酶Cel7A潜在的糖基化位点，得到可 以在毕赤氏酵母中高活性表达纤维素酶Cel7A的突变体。本专利技术为构建高活性表达纤维素 酶的重组酵母菌，有效地应用于生产中，提供一个新的技术。具体实施例方式以下将将结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，目的在于帮助读者更好的理 解本专利技术的精神实质，但不作为对本专利技术实施范围的限定。实施例针对需要突变的位点设计对应的引物，依据Cel7A的基因编码序列，设计第64位 天冬酰胺突变引物5，TGTCCTGACAGCGAGACCTGCGC 3，。以pUCmT_Cel7A为出发质粒，结合点突变试剂盒 GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System(Promega 公司) 进行定点突变。阳性转化子进行测序，验证突变位点的突变情况，测序结果表明第64位天 冬酰胺(AAC)已经突变为丝氨酸(AGC)。Cel7A N64S基因编码序列两端加入Not I酶切位点，经Not I酶切后连入到相 同酶切的质粒载体PPIC9K，将连接正确的pPIC9K-Cel7AN64S质粒，采用常规的电转化方 法转入到毕赤氏酵母，挑选正确的阳性转化子进行纤维素酶的表达和活性分析。以PNPC 为底物，测得的纤维素酶活力数据结果表明重组酵母表达的突变体N64S Cel7A，其酶活比 rCel7A高约7倍。N64S Cel7A的编码核苷酸序列ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAGTCGGCCTGCACTCTCCAATCGGAGACTCACCCGCCTCTGACATGGCAGAAATGCTCGTCTGGTGGCACGTGCACTCAACAGACAGGCTCCGTGGTCATCGACGCCAACTGGCGCTGGACTCACGCTACGAACAGCAGCACGAACTGCTACGATGGCAACACTTGGAGCTCGACCCTATGTCCTGACAGCGAGACCTGCGCGAAGAACTGCTGTCTGGACGGTGCCGCCTACGCGTCCACGTACGGAGTTACCACGAGCGGTAACAGCCTCTCCATTGGCTTTGTCACCCAGTCTGCGCAGAAGAACGTTGGCGCTCGCCTTTACCTTATGGCGAGCGACACGACCTACCAGGAATTCACCCTGCTTGGCAACGAGTTCTCTTTCGATGTCGATGTTTCGCAGCTGCCGTGCGGCTTGAACGGAGCTCTCTACTTCGTGTCCATGGACGCGGATGGTGGCGTGAGCAAGTATCCCACCAACACCGCTGGCGCCAAGTACGGCACGGGGTACTGTGACAGCCAGTGTCCCCGCGATCTGAAGTTCATCAATGGCCAGGCCAACGTTGAGGGCTGGGAGCCGTCATCCAACAACGCGAACACGGGCATTGGAGGACACGGAAGCTGCTGCTCTGAGATGGATATCTGGGAGGCCAACTCCATCTCCGAGGCTCTTACCCCCCACCCTTGCACGACTGTCGGCCAGGAGATCTGCGAGGGTGATGGGTGCGGCGGAACTTACTCCGATAACAGATATGGCGGCACTTGCGATCCCGATGGCTGCGACTGGAACCCATACCGCCTGGGCAACACCAGCTTCTACGGCCCTGGCTCAAGCTTTACCCACGATACCACCAAGAAATTGACCGTTGTCACCCAGTTCGAGACGTCGGGTGCCATCAACCGATACTATGTCCAGAATGGCGTCACTTTCCAGCAGCCCAACGCCGAGCTTGGTAGTTACTCTGGCAACGAGCTCAACGATGATTACTGCACAGCTGAGGAGGCAGAATTCGGCGGATCCTCTTTCTCAGACAAGGGCGGCCTGACTCAGTTCAAGAAGGCTACCTCTGGCGGCATGGTTCTGGTCATGAGTCTGTGGGATGATTACTACGCCAACATGCTGTGGCTGGACTCCACCTACCCGACAAACGAGACCTCCTCCACACCCGGTGCCGTGCGCGGAAGCTGCTCCACCAGCTCCGGTGTCCCTGCTCAGGTCGAATCTCAGTCTCCCAACGCCAAGGTCACCTTCTCCAACATCAAGTTCGGACCCATTGGCAGCACCGGCAACCCTAGCGGCGGCAACCCTCCCGGCGGAAACCCGCCTGGCACCACCACCACCCGCCGCCCAGCCACTACCACTGGAAGCTCTCCCGGACCTACCCAGTCTCACTACGGCCAGTGCGGCGGTATTGGCTACAGCGGCCCCACGGTCTGCGCCAGCGGCACAACTTGCCAGGTCCTGAACCCTTACTACTCTCAGTG本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一个适于毕赤氏酵母高活性表达的外切纤维素酶突变体，其特征在于，对纤维素酶潜在的糖基化位点进行改造，以获得可以在毕赤氏酵母中高活性表达的纤维素酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庄国强，刘巍峰，魏联果，伍国超，马安周，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：11
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