本发明专利技术提供肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、离心得到肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的粗酶液，先将粗酶液通过一次SP-Sepharose?FF层析分离为酶II和酶I、III，再将酶I、III再次过SP-Sepharose?FF分离为肝素酶I和肝素酶III；将得到的酶I和酶III分别各再过SP-Sepharose?FF两次，纯化得到高纯度的肝素酶I和III；将得到的酶II分别过HEP-Sepharose?4B、HA-Ultrogel、SP-Sepharose?FF，得到高纯度的肝素酶II。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种肝素酶I、II、III的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙全程保护之下、并含肝素缓冲液洗脱的特殊层析分离技术制备肝素酶I、II、III的方法。
技术介绍
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分别是分子量大约 43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9. 0左右，应用和研究非常广泛。肝素酶的纯化工作有许多研究报道，但因肝素酶是一种很容易失活的酶，已报道的纯化工艺中大都存在活性损失很大、收率低等缺点。Yang等人(J Biol Chem, 1985, 260(3) :1849-1857)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，制得纯肝素酶I，活性收率大约；Daniel等人(J Bio Chem, 1992, 267(34) =24347-24355)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石 HPLC,Mono-S FPLC、GPC_HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶I，活性回收率10. 8% ；马小来等人(食品与药品，2005，32 (5) =446-450)使用羟基磷灰石吸附/解吸、DEAE-kpharose 柱层析、CM-Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到肝素酶I，活性收率13. 4% ；Xiaolai Ma 等人(J Chrom B, 2006,843 (2) :209-215)通过硫酸铵沉淀、octyl-s印harose 柱层析、 CM-650柱层析、SP-650柱层析、s印hadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯化的肝素酶I， 收率达到17.8%，为所见的肝素酶I最高纯化收率。马小来等在2009年5月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶I制备方法”(专利申请号 200910039360. 1)中，建立了一种全新的纯化制备工艺，使肝素酶I在纯化过程中始终处于氯化钙的保护之下，从而获得高达30%的纯酶活性收率，制备的肝素酶I比活高达223IU/ mg，与已有最高技术相比，比活增加了两倍多，纯化收率增加将近一倍。本专利技术给出一种同时制备纯化出肝素酶I、II、III的方法，在氯化钙保护之下、并含肝素缓冲液洗脱的多步层析分离技术，最终制备肝素酶I、II、III的方法。方法高效、可重复，所得酶纯度极高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种肝素酶I、II、III的制备方法，该方法可同时纯化出3种酶，制备的肝素酶I、III比活高达417和235IU/mg，肝素酶II比活为 15. 3IU/mg。与已报道方法相比，酶I、III比活增加两倍，酶II比活接近最高报道。本专利技术包括下述步骤(1)肝素酶的粗酶液的发酵制备将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23°C， 150rpm，培养1天。然后按5 %接种量接入发酵培养基，23°C，150rpm，培养2-3天。菌液 10000rpm，4°C离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM iTris-HCl@缓冲液中，冰浴超声1小时(150W，5s，5s)。4°C，10000rpm，离心30min，向其中滴加0. 5g/ml的鱼精蛋白8ml, 搅拌，4°C，IOOOOrpm,离心30min，上清即为粗酶液。(2)粗酶的SP柱分离将步骤⑴所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCl@平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，两种酶呈两个活性峰I和II ；将活性峰II (靠后的那个)洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl @缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的TriS-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 2M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，呈两种酶呈两个活性峰III和IV ；(3)肝素酶I的纯化步骤( 活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl③缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I。(4)肝素酶III的纯化步骤( 活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris-HCl④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl④缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶III。(5)肝素酶II的纯化步骤(2)活性峰I洗脱液透析后上一根用IOmM Tris-HCl⑤缓冲液平衡过的HEP 柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. IM洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸钠缓冲液平衡过的HA 柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl@缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管， 洗脱液合并、透析，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶II。其中，步骤⑴所述的种子培养基的组成为牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉 0. 5%, NaCl 为 0. 5%, pH7. 0。步骤(1)所述的发酵培养基组成(g/L)为肝素8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5， NH4Cl2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMoO3, CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2, IX IO^4M) ο步骤(1)、(2)、(3)、(4)所述Tris-HCl @②缓冲液含 IOmM CaCl2, ρΗ6· 5-8. 0，优选 PH 范围为 7. 0-7. 5。步骤(3)、(4)所述Tri s-HCl 缓冲液含氯化钠5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，氯化钠含量的优选范围为25-45mM，肝素含量的优选范围为0. 1-0. 2%，肝素的种本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种肝素黄杆菌肝素酶的制备方法，所述方法包括下述步骤：（１）肝素酶的粗酶液的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到５０ｍｌ种子培养基中，２３℃，１５０ｒｐｍ，培养１天，然后按５％接种量接入发酵培养基，２３℃，１５０ｒｐｍ，培养２－３天。菌液１００００ｒｐｍ，４℃离心１５－３０分钟，收集沉淀，悬浮在１００ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ①缓冲液中，冰浴超声１小时；４℃，１００００ｒｐｍ，离心３０ｍｉｎ，向其中滴加０．５ｇ／ｍｌ的鱼精蛋白８ｍｌ，搅拌，４℃，１００００ｒｐｍ，离心３０ｍｉｎ，上清即为粗酶液；（２）粗酶的ＳＰ柱分离：将步骤（１）所得粗酶液上一根用１０－５０ｍＭ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ②平衡过的ＳＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度０－０．５Ｍ洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，两种酶呈两个活性峰Ｉ和ＩＩ；将活性峰ＩＩ洗脱液透析后上一根用５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ①缓冲液平衡过的ＳＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，以同样浓度的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中含氯化钠线形梯度０－０．２Ｍ洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，呈两种酶呈两个活性峰ＩＩＩ和ＩＶ；（３）肝素酶Ｉ的纯化：步骤（２）活性峰ＩＩＩ洗脱液透析后上一根用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ③缓冲液平衡过的ＳＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ③缓冲液中含氯化钠线形梯度０－０．５Ｍ洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ②缓冲液平衡过的ＳＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，以同样浓度的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中含氯化钠线形梯度０－０．５Ｍ洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量１０ｋｄ的超滤离心管浓缩，得到肝素酶Ｉ；（４）肝素酶ＩＩＩ的纯化：步骤（２）活性峰ＩＶ洗脱液透析后上一根用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ④缓冲液平衡过的ＳＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ④缓冲液中含氯化钠线形梯度０－０．５Ｍ洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ②缓冲液平衡过的ＳＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，以同样浓度的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中含氯化钠线形梯度０－０．５Ｍ洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量１０ｋｄ的超滤离心管浓缩，得到肝素酶ＩＩＩ；（５）肝素酶ＩＩ的纯化：步骤（２）活性峰Ｉ洗脱液透析后上一根用１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ⑤缓冲液平衡过的ＨＥＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ⑤缓冲液中含氯化钠线形梯度０－０．１Ｍ洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用５０ｍＭ磷酸－磷酸钠缓冲液平衡过的ＨＡ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度０－１．５Ｍ洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ②缓冲液平衡过的ＳＰ柱，以同样缓冲液平衡３个柱体积，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ②缓冲液中含氯化钠线形梯度０－０．５Ｍ洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量１０ｋｄ的超滤离心管浓缩，得到肝素酶ＩＩ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马小来，史绍鹏，李锂，
申请(专利权)人：深圳市海普瑞药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：94
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