一种肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法技术

本发明专利技术提供肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、离心得到肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的粗酶液，先将粗酶液通过一次SP-Sepharose?FF层析分离为酶II和酶I、III，再将酶I、III再次过SP-Sepharose?FF分离为肝素酶I和肝素酶III；将得到的酶I和酶III分别各再过SP-Sepharose?FF两次，纯化得到高纯度的肝素酶I和III；将得到的酶II分别过HEP-Sepharose?4B、HA-Ultrogel、SP-Sepharose?FF，得到高纯度的肝素酶II。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肝素酶I、II、III的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙全程保护之下、并含肝素缓冲液洗脱的特殊层析分离技术制备肝素酶I、II、III的方法。
技术介绍
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分别是分子量大约 43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9. 0左右，应用和研究非常广泛。肝素酶的纯化工作有许多研究报道，但因肝素酶是一种很容易失活的酶，已报道的纯化工艺中大都存在活性损失很大、收率低等缺点。Yang等人(J Biol Chem, 1985, 260(3) :1849-1857)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，制得纯肝素酶I，活性收率大约；Daniel等人(J Bio 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种肝素黄杆菌肝素酶的制备方法，所述方法包括下述步骤：（１）肝素酶的粗酶液的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到５０ｍｌ种子培养基中，２３℃，１５０ｒｐｍ，培养１天，然后按５％接种量接入发酵培养基，２３℃，１５０ｒｐｍ，培养２－３天。菌液１００００ｒｐｍ，４℃离心１５－３０分钟，收集沉淀，悬浮在１００ｍｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ①缓冲液中，冰浴超声１小时；４℃，１００００ｒｐｍ，离心３０ｍｉｎ，向其中滴加０．５ｇ／ｍｌ的鱼精蛋白８ｍｌ，搅拌，４℃，１００００ｒｐｍ，离心３０ｍｉｎ，上清即为粗酶液；（２）粗酶的ＳＰ柱分离：将步骤（１）所得粗酶液上一根用１０－５０ｍＭ的Ｔｒｉ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马小来，史绍鹏，李锂，
申请(专利权)人：深圳市海普瑞药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：94