一种1, 4-β-D-木聚糖酶突变体制造技术

本发明专利技术属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及1,4-β-D-木聚糖酶突变体。本发明专利技术使用易错PCR方法、DNA改组技术对该酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出。并结合基于序列比对的半理性设计方法确定部分潜在热稳定相关位点，再通过定点突变方法得到热稳定相关突变体。经上述突变文库构建、筛选以及半理性设计方法，获得20个热稳定性显著提高的突变体，其热失活半衰期比野生型提高2-52倍，显示出在造纸制浆、生物能源等工业上潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及耐热性提高的1，4-A-D-木聚糖酶突变体。
技术介绍
木聚糖酶(endo-1，4-/ -xylanases, EC 3. 2. 1. 8)以内切方式水解木聚糖分子中的办-1，4-糖苷键，生成低聚木糖和木糖，是半纤维素水解酶系中最关键的水解酶之一，在工业上具有重要的应用价值。自上世纪80年代木聚糖酶开始工业应用以来，木聚糖酶的应用领域不断扩大，目前已经在饲料、制浆造纸、食品、能源等行业中得到广泛应用。随着木聚糖酶的应用范围进一步拓展，工业上对其现有性能提出了更高的要求，如长时间内保持活性稳定，在极端环境中保持高的活性(极端温度或者PH值等)或者可以接受不同的底物(包括非天然底物)。其中酶的热稳定性对于工业应用来说十分重要，而且高温条件下， 酶的反应速度更快，能缩短反应周期，节约成本，也有利于避免反应过程中被其他微生物污^fe ο随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有许多学者运用这项技术成功的改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展(Zhao，2007， Biotechnogy and Bioengineering 98 (2)，271—275)。胃巾胃辛昔 PCR(error—prone PCR)、 DNA改组(DNA shuffling)、半理性设计等已成为酶的分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白质的进化过禾呈(Lehmann and Wyss, 2001 Current Opinion in Biotechnology 12(4), 371-375 )。
技术实现思路
本专利技术的目的在于采用定向进化技术同时结合基于序列比对的半理性设计方法对来源于Geobacillus stearothermophilus的1，β -D-木聚糖酶ΧΤ6进行分子改造， 获得热稳定性提高的木聚糖酶突变体。为达到上述目的，本专利技术使用多轮易错PCR方法、DNA改组技术对1，-D-木聚糖酶ΧΤ6基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，同时使用半理性设计方法确定部分潜在热稳定相关位点，再通过定点突变方法得到热稳定相关突变体。本专利技术的具体实施方法为来源于stearothermophilus (^mhankyH号为 Z^080)的木聚糖酶 XT6 由 379 个氨基酸组成(Lapidot, Mechaly et al.，1996 Journal of Biotechnogy 51(3)，259-264)(见 SEQ ID NO. 1)。为迅速得到 XT6 全基因序列并提高其在大肠杆菌中的表达量，以利于对XT6酶分子的改造，根据已报道的XT6基因序列信息(Gat, Lapidot et al.，1994 Applied and Environmental Microbiology 60(6)， 1889-1896)，采用基于PCR的全基因合成方法合成了木聚糖酶XT6全基因序列。同时根据大肠杆菌密码子偏好性对其DNA序列进行优化(在线软件DNAWorks，Α /7.· //helixweb. nih.^^/ofearorAs/，优化合成的的木聚糖酶XT6基因序列为SEQ ID NO. 2)，功能正常的酶蛋白在大肠杆菌BL21-DE3 中过量表达Siang, Pei et al., 2009 Chinese Journal of Applied and Environmental Biology 15(2), 271-275)。采用易错 PCR 方法、DNA 改组技术对其进行随机突变，以PET 28a (+)载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主 E. coli BL21-DE3中，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。离心重悬后，取部分菌液加入1% 浓度木聚糖底物反应适当时间后，以DNS法终止反应，测定酶活性。同时，另取部分菌液热处理一定时间，测定残余活性。残余活性高于对照的菌株转接到新的96孔培养板中，进行重复筛选。将筛选得到的残余活性高于对照的菌株，送上海英骏生物技术有限公司测序，获得突变体DNA序列信息。详细方案见实施例2。同时采用基于序列比对的半理性设计方法获得热稳定突变体((Lehmarm，Loch et al. , 2002 Protein engineering 15(5)，403-411)。具体做法为，首先将 XT6 氨基酸序列与其他不同来源的17条木聚糖酶氨基酸序列进行比对，初步确定有可能影响酶稳定性的位点，通过定点突变得到各个位点的单点突变体，测定其热失活半衰期，并与野生型比较，得到酶热稳定性的突变体F360L。详细方案见实施例6。经上述对构建的突变文库筛选以及半理性设计方法，获得20个热稳定性提高的突变体，分别为 10E11、05D03、09D05、08A07、05F03、04D08、04F06、04H09、08G01、06B01、 04D03、03B11、04H12、02E04、06H07、F360L、FAM、FAMG, FTAMG 禾Π FC06T，序列信息见 SEQ ID Ν0. 3—NO. 22，其特征如下10E11 该酶的第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(DNA序列由TTT变为TAT)。05D03 该酶的第256位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GAT)、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。09D05 该酶的第120位的苏氨酸突变为异亮氨酸(ACC变为ATC)、第363位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)。08Α07 该酶的第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。05F03 该酶的256位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第363位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)。04D08 该酶的第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第72位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第270 位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。04F06 该酶的第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第363位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)、第379位的赖氨酸突变为苏氨酸(AAA变为ACA)。04H09 该酶的第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为TAT)、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第379 位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)。08G01 该酶的第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第112位的谷氨酸突变为天冬氨酸(GAA变为GAT)、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第270 位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。06Β01 该酶的第212位的苏氨酸突变为异亮氨酸(ACT变为ATT)、第256位的丙氨酸突变为亮氨酸(GCA变为TTA)、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ATA )、第363位的甘氨酸突变为天冬本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　一种１，　４－β－Ｄ－木聚糖酶突变体，其特征在于：以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示的１，　４－β－Ｄ－木聚糖酶ＸＴ６氨基酸序列为基础，经突变后具有以下２０个突变体中任一项所述特征的氨基酸序列：将其第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，或者第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸且第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第１２０位的苏氨酸突变为异亮氨酸且第３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且氨酸突变为天冬氨酸、第２１８位缬氨酸突变为丙氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸、第３６０位的苯丙氨酸突变为亮氨酸、第３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸且３７９位的赖氨酸突变为天冬酰胺。６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第１６位的天冬酰胺突变为赖氨酸、第２５位的赖氨酸突变为异亮氨酸、第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第７２位赖氨酸突变为异亮氨酸、第１１２位谷氨酸突变为天冬氨酸、第１２０位的苏氨酸突变为异亮氨酸、第１３７位的谷酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第１２０位的苏氨酸突变为异亮氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且３酸、第３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸且３７９位的赖氨酸突变为天冬酰胺，或者第３６０位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸且２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨为缬氨酸且第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第７２位的赖氨酸突变为异亮氨酸、第１２０位的苏氨酸突变为异亮氨酸、第２１８位的缬氨酸突变为丙氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸突变为天冬氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第１１５位的脯氨酸突变为苏氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸且２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第１６位的天冬酰胺突变为赖氨酸、第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第２５６位的丙氨酸突变丙氨酸突变为酪氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且第３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第１３７位的谷氨酸突变为天冬氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且第３６３位的甘氨位的丙氨酸突变为缬氨酸且２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第２１２位的苏氨酸突变为异亮氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为亮氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第２５位的赖氨酸突变为异亮氨酸、第５２位的苯７９位的赖氨酸突变为苏氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸、第２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且３７９位的赖氨酸突变为异亮氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第１１２位的谷氨酸突变为天冬氨酸、第２５６第３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第７２位的赖氨酸突变为异亮氨酸、第２５６位的丙氨酸突变为缬氨酸且２７０位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第５２位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第３６３位的甘氨酸突变为天冬氨酸且第３...

【技术特征摘要】
1.一种1，4-A-D-木聚糖酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO. 1所示的1， 4-A -D-木聚糖酶XT6氨基酸序列为基础，经突变后具有以下20个突变体中任一项所述特征的氨基酸序列将其第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，或者第256位的丙氨酸突变为缬氨酸且第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第120位的苏氨酸突变为异亮氨酸且第363 位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第256位的丙氨酸突变为缬氨酸、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且第363位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第72位的赖氨酸突变为异亮氨酸、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸且270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第363位的甘氨酸突变为天冬氨酸且第379位的赖氨酸突变为苏氨酸，或者第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且379位的赖氨酸突变为异亮氨酸，或者第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第112位的谷氨酸突变为天冬氨酸、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸且270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，或者第212位的苏氨酸突变为异亮氨酸、第256位的丙氨酸突变为亮氨酸、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且363位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第25位的赖氨酸突变为异亮氨酸、第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且第363位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第137位的谷氨酸突变为天冬氨酸、第256位的丙氨酸突变为缬氨酸、第270位的蛋氨酸突变为异亮氨酸且第363 位的甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第52位的苯丙氨酸突变为酪氨酸、第115位的脯氨酸突变为苏氨酸、第256位的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴中柳，张志刚，刘艳，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：90