通过添加槐糖脂进行诱导发酵生产纤维素酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过添加槐糖脂进行诱导发酵生产纤维素酶的方法，实施步骤如下：（1）种子培养；首先将培养好的里氏木霉菌种接种到灭过菌的种子培养基中，在28-30℃培养，培养时间为68-72h；（2）发酵培养基灭菌；发酵培养基经121℃，20min灭菌后，pH为5.0，冷却至28-30℃；（3）发酵；将种子液以5%-10%的接种量转移至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐的装液量为3L，控制发酵温度为28-30℃，pH5.0，发酵40h后每隔2h取样测定菌体浓度；（4）槐糖脂灭菌；（5）槐糖脂诱导；（6）纤维素酶粗提取。本发明专利技术采用添加槐糖脂进行诱导发酵生产纤维素酶的方法，有效的诱导了纤维素酶的合成，获得了较高的纤维素酶活，降低了生产纤维素酶的成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种发酵生产纤维素酶的方法，特别涉及一种。
技术介绍
纤维素酶是一组可以把固体纤维素水解为葡萄糖的酶类，水解得到的葡萄糖又可以作为生产许多发酵产品的底物，其中包括可再生的替代资源燃料乙醇。大规模廉价生产纤维素酶对于经济的进行木质纤维素的精制工艺非常重要。许多物质如纤维素、羧甲基纤维素、各种纤维素水解物、乳糖、槐糖、半乳糖等都被认为是生物合成纤维素酶的潜在诱导物。其中，乳糖是现今认为的最经济可行的工业化纤维素酶生产诱导物。槐糖很早就被认为是合成纤维素酶的最有效的可溶性诱导物，但是槐糖价格非常曰虫 P卩贝。槐糖脂是一类生物表面活性剂，包含一个槐糖，槐糖通过糖苷键与羟基脂肪酸相连。这种糖脂可由酵母菌以适当比例的葡萄糖和脂类为底物大量生产(大于120g/L)。国外研究表明，利用槐糖脂诱导生产纤维素酶是可行的。因此，提供一种制备简单，效果显著的，是该领域科研开发人员需要研究解决的一大课题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足之处，提供一种制备简单，效果显著的。为实现纤维素酶合成的有效诱导，同时降低诱导物生产成本的目的，本专利技术使用槐糖脂作为纤维素酶生产的诱导物。为实现上述目的本专利技术所采用的实施方式如下一种，其特征在于实施步骤如下(1)种子培养种子培养基组成包括，单位1L:纤维素10g，酵母抽提物10g，甘油10g，(NH4)2SO4 1.4 g, KH2PO4 2g, CaCl2 · 2H20 0. 4g, MgSO4 · 7H20 0. 3 g, FeSO4 · 7H20 0. 005 g, CoCl2 · 6H20 0. 0037 g, MnSO4 · H2O 0. 0016g, ZnSO4 · 7H20 0. 0014 g，用蒸馏水定容至 1L, pH 值 5· 0 ；所用菌种里氏木霉TJZKBI0956 ；首先将培养好的里氏木霉菌种接种到灭过菌的种子培养基中，在28-30°C培养，培养时间为68-72h，即得种子液；(2)发酵培养基灭菌发酵培养基经121°C，20min灭菌后，pH为5. 0，冷却至28-30°C ；发酵培养基组成包括，单位 IL 纤维素 50g，酵母抽提物 10g, (NH4)2SO4 1. 4 g，KH2PO4 2g，CaCl2 · 2H20 0. 4g， MgSO4 · 7H20 0. 3 g, FeSO4 · 7H20 0. 005 g, CoCl2 · 6H20 0. 0037 g, MnSO4 · H2O 0. 0016g, ZnSO4 · 7H20 0. 0014 g，用蒸馏水定容至 1L，pH 值 5· 0 ；(3)发酵将种子液以5%-10%的接种量转移至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐的装液量为3L，控制发酵温度为28-30°C，pH5. 0，发酵40h后每隔2h取样测定菌体浓度；(4)槐糖脂灭菌分别使用发酵制备的纯度为95%的槐糖脂和浓度为150g/L的槐糖脂发酵液作为诱导剂，均用自来水溶解分别配制成终浓度为10g/L的溶液，在121°C灭菌20min后，冷却至 28-30 0C ；(5)槐糖脂诱导发酵罐经45-48h发酵后，菌体达到对数生长后期，此时一次性添加槐糖脂溶液至发酵液中，使其终浓度为lg/L，或者进行间歇性补加，连续补加3d，一天中分四次补加槐糖脂， 每次间隔时间均为2h，每天补加槐糖脂的间隔时间为16h，使发酵液中槐糖脂的终浓度为 lg/L ；(6)纤维素酶粗提取整个发酵时间持续6d，发酵结束后发酵液经过滤布过滤，滤液经过0. IMpa, 55°C减压浓缩，后进行喷粉干燥，喷粉时进料口温度为135°C，出料口温度为60°C，得到纤维素酶粗制品；纤维素酶的活力使用滤纸酶活(FPA)测定法测定，酶活为5000-5100国际单位(IU)。本专利技术的有益效果是本专利技术采用添加槐糖脂进行诱导发酵生产纤维素酶的方法，有效的诱导了纤维素酶的合成，其诱导效率是乳糖诱导效率的10倍，并且获得了较高的纤维素酶活，使纤维素酶的生产成本至少降低了 50%。本专利技术工艺简单，效果非常显著； 比传统纤维素酶的生产方法的效率提高了 10倍，同时使生产成本降低了 50%。具体实施例方式以下结合较佳实施例，对依据本专利技术提供的具体实施方式详述如下 实施例1(1)种子培养种子培养基组成包括，单位1L:纤维素10g，酵母抽提物10g，甘油10g，(NH4)2SO4 1.4 g, KH2PO4 2g, CaCl2 · 2H20 0. 4g, MgSO4 · 7H20 0. 3 g, FeSO4 · 7H20 0. 005 g, CoCl2 · 6H20 0. 0037 g, MnSO4 · H2O 0. 0016g, ZnSO4 · 7H20 0. 0014 g，用蒸馏水定容至 1L, pH 值 5· 0 ；所用菌种里氏木霉TJZKBI0956 ；首先将培养好的里氏木霉菌种接种到灭过菌的种子培养基中，在30°C培养，培养时间为68h，即得种子液；(2)发酵培养基灭菌发酵培养基经121°C，20min灭菌后，pH为5. 0，冷却至30°C ；发酵培养基组成包括，单位 IL 纤维素 50g，酵母抽提物 10g，(NH4)2SO4 1.4 g，KH2PO4 2g，CaCl2 ·2Η20 0. 4g, MgSO4 ·7Η20 0. 3 g, FeSO4 · 7Η20 0. 005 g, CoCl2 · 6Η20 0. 0037 g, MnSO4 · H2O 0. 0016g, ZnSO4 · 7Η20 0. 0014 g，用蒸馏水定容至1L，pH值5. 0 ；(3)发酵将种子液以5%接种量转移至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐的装液量为3L，控制发酵温度为30°C，pH5. 0，发酵40h后每隔2h取样测定菌体浓度；(4)槐糖脂灭菌将上述纯度为95%的槐糖脂用自来水溶解，配制成终浓度为10g/L的溶液，在121°C灭菌20min后，冷却至30 V备用。(5)槐糖脂诱导发酵罐经48h发酵后，菌体达到对数生长后期，此时一次性添加槐糖脂溶液300mL至发酵液中，使其终浓度为lg/L。(6)纤维素酶粗提取整个发酵时间持续6d，发酵结束后发酵液经过滤布过滤，滤液经过0. IMpa, 55°C减压浓缩，后进行喷粉干燥，喷粉时进料口温度为135°C，出料口温度为60°C，得到纤维素酶粗制品。纤维素酶的活力使用滤纸酶活(FPA)测定法测定，酶活为5040 IU0实施例2 (1)种子培养种子培养基组成包括，单位1L:纤维素10g，酵母抽提物10g，甘油10g，(NH4)2SO4 1.4 g, KH2PO4 2g, CaCl2 · 2H20 0. 4g, MgSO4 · 7H20 0. 3 g, FeSO4 · 7H20 0. 005 g, CoCl2 · 6H20 0. 0037 g, MnSO4 · H2O 0. 0016g, ZnSO4 · 7H20 0. 0014 g，用蒸馏水定容至 1L, pH 值 5· 0 ；所用菌种里氏木霉TJZKBI0956 ；首先将培养好的里氏木霉菌种接种到灭过菌的种子培养基中，在30°C培养，培养时间为68h，即得种子液。(2)发酵培养基灭菌发酵培养基经121°C，20m本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种通过添加槐糖脂进行诱导发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于实施步骤如下：（１）种子培养种子培养基组成包括，单位１Ｌ：纤维素１０ｇ，酵母抽提物１０ｇ，甘油１０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．４　ｇ，ＫＨ２ＰＯ４　２ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ０．４ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．３　ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．００５　ｇ，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ　０．００３７　ｇ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ　０．００１６ｇ，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．００１４　ｇ，用蒸馏水定容至１Ｌ，ｐＨ值５．０；所用菌种：里氏木霉ＴＪＺＫＢＩＯ９５６；首先将培养好的里氏木霉菌种接种到灭过菌的种子培养基中，在２８－３０℃培养，培养时间为６８－７２ｈ，即得种子液；（２）发酵培养基灭菌发酵培养基经１２１℃，２０ｍｉｎ灭菌后，ｐＨ为５．０，冷却至２８－３０℃；发酵培养基组成包括，单位１Ｌ：纤维素５０ｇ，酵母抽提物１０ｇ，　（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．４　ｇ，ＫＨ２ＰＯ４　２ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ　０．４ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．３　ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．００５　ｇ，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ　０．００３７　ｇ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ　０．００１６ｇ，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．００１４　ｇ，用蒸馏水定容至１Ｌ，ｐＨ值５．０；（３）发酵将种子液以５％－１０％的接种量转移至灭菌后的５Ｌ发酵罐中，发酵罐的装液量为３Ｌ，控制发酵温度为２８－３０℃，ｐＨ５．０，发酵４０ｈ后每隔２ｈ取样测定菌体浓度；（４）槐糖脂灭菌分别使用发酵制备的纯度为９５％的槐糖脂和浓度为１５０ｇ／Ｌ的槐糖脂发酵液作为诱导剂，均用自来水溶解分别配制成终浓度为１０ｇ／Ｌ的溶液，在１２１℃灭菌２０ｍｉｎ后，冷却至２８－３０℃；（５）槐糖脂诱导发酵罐经４５－４８ｈ发酵后，菌体达到对数生长后期，此时一次性添加槐糖脂溶液至发酵液中，使其终浓度为１ｇ／Ｌ，或者进行间歇性补加，连续补加３ｄ，一天中分四次补加槐糖脂，每次间隔时间均为２ｈ，每天补加槐糖脂的间隔时间为１６ｈ，使发酵液中槐糖脂的终浓度为１ｇ／Ｌ；（６）纤维素酶粗提取整个发酵时间持续６ｄ，发酵结束后发酵液经过滤布过滤，滤液经过０．１Ｍｐａ，５５℃减压浓缩，后进行喷粉干燥，喷粉时进料口温度为１３５℃，出料口温度为６０℃，得到纤维素酶粗制品；纤维素酶的活力使用滤纸酶活（ＦＰＡ）测定法测定，酶活为５０００－５１００　ＩＵ。...

【技术特征摘要】
1. 一种通过添加槐糖脂进行诱导发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于实施步骤如下(1)种子培养种子培养基组成包括，单位1L:纤维素10g，酵母抽提物10g，甘油10g，(NH4)2SO4 1.4 g, KH2PO4 2g, CaCl2 · 2H20 0. 4g, MgSO4 · 7H20 0. 3 g, FeSO4 · 7H20 0. 005 g, CoCl2 · 6H20 0. 0037 g, MnSO4 · H2O 0. 0016g, ZnSO4 · 7H20 0. 0014 g，用蒸馏水定容至 1L, pH 值 5· 0 ；所用菌种里氏木霉TJZKBI0956 ；首先将培养好的里氏木霉菌种接种到灭过菌的种子培养基中，在28-30°C培养，培养时间为68-72h，即得种子液；(2)发酵培养基灭菌发酵培养基经121°C，20min灭菌后，pH为5. 0，冷却至28-30°C ；发酵培养基组成包括，单位 IL 纤维素 50g，酵母抽提物 10g, (NH4)2SO4 1. 4 g，KH2PO4 2g，CaCl2 · 2H20 0. 4g， MgSO4 · 7H20 0. 3 g, FeSO4 · 7H20 0. 005 g, CoCl2 · 6H20 0. 0037 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐勇虎，刘云，李睿颖，国华，胡娅君，韩慧，王晓琼，范婷，
申请(专利权)人：天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：12