基于调节培养基中溶解氧压力振荡以生产纤维素酶的方法技术

本发明专利技术涉及基于调节培养基中溶解氧压力振荡以生产纤维素酶的方法。具体地，本发明专利技术涉及一种在搅拌的和通气的生物反应器中通过分解纤维素的微生物来生产分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的方法，该方法包括在碳源存在下的生长阶段和在含碳诱导底物存在下的生产阶段，其中在生产阶段过程中含碳诱导底物的供给是通过培养基中溶解氧分压的振荡来调节的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产用于木质纤维素生物质水解的酶的方法。
技术介绍
木质纤维素生物质的特征在于由三种主要的聚合物纤维素、半纤维素和木质素组成的复杂的结构。纤维素和可能地半纤维素是酶促水解的靶，但是它们不可直接接近酶。因此，在酶促水解阶段之前这些底物必须经过预处理。所述预处理的目的在于修饰木质纤维素材料的物理的和物理化学的性质，以提高截留在木质素和半纤维素基质中的纤维素的可接近性。这些预处理可以是不同的类型酸法煮沸(acidic boiling)、碱法煮沸(alkaline boiling)、蒸爆(steam explosion)或者有机溶齐Ll (Organosolv)过程可以被提及。酶促水解阶段允许使用分解纤维素的和/或分解半纤维素的 (hemicellulolytic)酶使纤维素和半纤维素转化为糖。微生物生产这些显著含有纤维素酶和半纤维素酶的酶，所生产的这些酶适合于完全水解纤维素和半纤维素，所述微生物例如属于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)或者裂褶菌属 (Schizophyllum)的真菌，或者例如属于梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的厌氧细菌。通过木质纤维素生物质水解所得到的糖是戊糖(主要为木糖和阿拉伯糖)、二糖类(纤维二糖)和葡萄糖，其可以被微生物发酵。例如，在酒精发酵阶段过程中，通过啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母可以容易地将葡萄糖转化为乙醇。最后，蒸馏阶段允许从发酵葡萄汁中分离和回收这样所得到的发酵产物，在前面的实例中这样所得到的发酵产物是乙醇。各种技术经济(technico-economic)研究显示为了使所生产的乙醇的成本达到接近于从淀粉中获得的乙醇的值，必须降低与酶促水解阶段相关的成本。降低成本的一种方法在于最优化纤维素酶生产方法的操作条件，以便于增加生产力或者得到具有提高的比活性的酶的混合物。纤维素酶生产中最普遍使用的微生物是丝状的里氏木霉(Trichoderma reesei) 真菌。在诱导底物(例如纤维素或者乳糖)存在的情况下，野生菌株有分泌例如适于纤维素水解的酶复合物的能力。所述酶复合物的酶包括三种主要类型的活性内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。对于纤维素酶在反应器中的生产来说，复杂的纤维素酶合成调节机制需要特殊的仪器。采用对分解代谢阻抑不敏感的菌株和能大规模使用的可溶性诱导底物(例如乳糖) 已经允许获得有效的生产，所述有效的生产约为根据Bioresource Technol. (1992)39， 125-130中描述的方法，通过里氏木霉(T.reeSei)CL 847的40g/L细胞外的蛋白质。在这个方法中，在两个阶段发生发酵，里氏木霉(T. reesei)细胞的分批生产的第一个阶段和以防止在培养基中积累的速度补料分批供给诱导物的第二个阶段。对于酶生产来说微生物的生理状态并不总是保持在其最优水平，在一些情况中观察到无效细胞生长的现象，或者导致酶生产力降低的不需要的细胞的溶胞作用或者孢子形成。最优生产状态和不需要的生理状态之间的平衡是相当敏感的。Bailey等人(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003,62 :156-162)已经显示出当细胞处于接近于在培养基中含碳底物限制的状态时，纤维素酶的生产力是最优的。已经建议采用监控用于PH控制的基本消耗速度来添加含碳底物的方法。此外，在专利ΕΡ-Β1-0，448，430中描述的方法要求最优的糖供给率为35_45mg. f.h—1。事实上，过高的供给率导致培养基中含碳底物的积累，所述含碳底物的积累导致代谢朝向生物质生产而不是酶生产的方向变化。另一方面，过低的供给率导致生物质裂解和生产损失。此外，里氏木霉(Trichoderma reesei)分泌更多的蛋白酶，再消耗部分所生产的纤维素酶。本专利技术提供了一种对于酶生产来说允许使微生物保持在对应于其最优水平的状态的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种生产分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的方法，其中生产阶段所需要的含碳诱导底物的供给是通过培养基中溶解氧压力的振荡来调节的。附图说明图1显示出培养基中溶解氧压力作为时间函数的记录，以及含碳底物的供给率。 具体实施例方式本专利技术涉及一种在搅拌的和通气的生物反应器中通过分解纤维素的微生物来生产分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶的方法，该方法包括在碳源存在下的生长阶段和在含碳诱导底物存在下的生产阶段，其中在生产阶段过程中含碳诱导底物的供给是根据生长培养基中的溶解氧分压来调节的，所述的压力振荡介于Po2min* Po2max两个值之间，Po2fflin 的值高于在其下微生物活性受影响的临界压力Po2。Hti。al，且低于启动生物反应器时设置的饱和氧分压Po2sat的95%，并且Po2max的值比Po2min至少高5%，培养基中溶解氧分压一高于 Po2fflax值，就启动含碳诱导底物的添加，且培养基中溶解氧压力一低于Po2min值，就终止含碳诱导底物的添加。这个方法允许在保持细胞处于最优生产力阶段的同时，最优化分解纤维素的和/ 或分解半纤维素的酶的生产。通过根据本专利技术所述的方法，生产显示出比活性最高达比采用常规生产方法所获得的酶的比活性高50%的酶的混合物是可能的，在常规生产方法中由恒定供给率施加碳限制。此外，这种方法提供了对仪器来说耐用和简单的优点。该方法也允许避免培养基中糖的积累，所述糖的积累导致生物质以酶生产为代价而形成。在与微生物菌株生长和酶生产相容的条件下，在搅拌的和通气的生物反应器中培养所用的微生物菌株。在发酵开始时，生物反应器处于氧饱和状态，且与饱和对应的溶解氧分压以Po2sat来表不。生长阶段所用的碳源被进料到生物反应器中，以使生产阶段开始时具有范围在 15-60g/L之间的初始糖浓度。在生长阶段过程中，通气是以操作员选定的值来设定的，且氧分压Po2是通过搅拌以一定百分率的饱和压力来调节的，其中该百分率由操作员定义。培养基中的氧分压必须高于在其下微生物活性受影响的临界氧压力Po2CTiti。al。Po2critical的值对于本领域技术人员来说是公知的，且它依赖于所用的微生物。它可被定义为这样的压力，在该压力下通过降低细胞生存力或者降低目的代谢物的生产而影响微生物的代谢。在生产阶段过程中，生物反应器的搅拌和通气是以预先确定的值来设定的，从而允许对于所述生物反应器而言具有与Kla值对应的充氧能力，所述Kla值取决于最初考虑的生物质，范围在50-15( -1之间。在根据本专利技术所述的方法中，在耗尽初始底物之后，引入含碳诱导底物这是生产阶段的开始。氧消耗率与微生物所消耗的含碳诱导底物的消耗率成比例。因此，发酵罐中糖的小积累导致氧分压的下降。当测量的氧分压达到最小值Po2min 时，系统调节终止含碳诱导底物的添加。此终止导致在含碳诱导底物浓度接近于微生物对于含碳底物的亲和常数Ks时所述含碳诱导底物消耗率的降低。此终止也导致氧消耗率的降低，所述氧消耗率的降低导致氧分压升高到Po2max值。当达到压力Po2max时，系统调节又启动含碳诱导底物供给泵。发酵培养基中溶解氧分压在Po2mil^P Po2ma本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．在搅拌的和通气的生物反应器中通过分解纤维素的微生物生产分解纤维素的和／或分解半纤维素的酶的方法，该方法包括在碳源存在下的生长阶段和在含碳诱导底物存在下的生产阶段，其中生产阶段过程中含碳诱导底物的供给是根据生长培养基中的溶解氧分压调节的，所述的压力振荡介于Ｐｏ２ｍｉｎ和Ｐｏ２ｍａｘ两个值之间，Ｐｏ２ｍｉｎ的值高于在其下微生物活性受影响的临界压力Ｐｏ２ｃｒｉｔｉｃａｌ，且低于启动生物反应器时设置的饱和氧分压Ｐｏ２ｓａｔ的９５％，且Ｐｏ２ｍａｘ的值比Ｐｏ２ｍｉｎ至少高５％，培养基中溶解氧分压一高于Ｐｏ２ｍａｘ值，就启动含碳诱导底物的添加，且培养基中溶解氧压力一低于Ｐｏ２ｍｉｎ值，就终止含碳诱导底物的添加。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：F·本沙巴尼，C·科昂，
申请(专利权)人：IFP新能源公司，
类型：发明
国别省市：FR