【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，具体涉及一种耐热型壳聚糖酶突变体及其应用。
技术介绍
1、高度脱乙酰化的几丁质被称为壳聚糖(脱乙酰度＞50％)，其由n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和d-氨基葡萄糖(glcn)通过β-1,4-糖苷键随机组合连接而成。以高分子量的壳聚糖为底物可以通过物理法、化学法、酶法等方式制备获取聚合度为2～20的壳寡糖(cos)。与几丁质和壳聚糖相比，cos在抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降胆固醇、抗感染、治疗炎症、治疗阿尔兹海默症等方面表现出更优越的生理活性，可广泛应用于药物治疗、化妆品、营养食品添加剂等领域。
2、与物理和化学法相比，酶法制备cos具有反应条件温和、环境友好、水解产物组成稳定等优点。因此，酶法制备cos具有良好的工业应用前景。
3、由于壳聚糖具有高分子聚合物的固有特性，即使是低浓度的壳聚糖溶液也具有明显的黏度，极大阻碍了酶法降解壳聚糖的规模化应用。针对这一问题，研究者发现：通过提高反应体系的温度可以破坏壳聚糖分子间的相互作用，从而显著改善溶液粘性。但野生型壳聚糖酶在高温下往往容易失活，限制了壳寡糖制备及其功能的研究。
4、综上，鉴于野生型壳聚糖酶存在活性低、热稳定性差等问题，工业应用受限，如果能增强壳聚糖酶的热稳定性，将有望扩大壳聚糖酶的应用场景，提高壳聚糖酶的转化效率，降低壳聚糖酶工业制备壳寡糖的生产成本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种耐热型壳聚糖酶突变体及其应用。
2、为实现上述专利技术
3、相应的，一种壳聚糖酶突变体，在野生型壳聚糖酶基础上，进行如下突变：将第49位丙氨酸突变为甘氨酸、将第70位赖氨酸突变为丙氨酸、将第84位的丝氨酸突变为丙氨酸、将第89位的天冬酰胺突变为甘氨酸、将第199位的天冬氨酸突变为精氨酸、将第221位的天冬酰胺突变为甘氨基酸；所述野生型壳聚糖酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
4、相应的，编码所述壳聚糖酶突变体的dna。
5、相应的，含有所述dna的表达质粒。
6、相应的，含有表达所述壳聚糖酶突变体对应氨基酸的核苷酸的重组质粒。
7、相应的，含有所述表达质粒或含有所述重组质粒的宿主微生物。
8、相应的，一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，利用编码所述壳聚糖酶突变体的dna替换编码野生型壳聚糖酶的dna。
9、相应的，所述壳聚糖酶在制备壳寡糖中的应用。
10、相应的，所述壳聚糖酶在酶解壳聚糖中的应用。
11、优选的，所述应用温度为：30～65℃；和/或；所述应用的ph为：4.5～6.5。
12、本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过对来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的壳聚糖酶进行了分子改造，在野生型壳聚糖酶的第49、70、84、89、199、221位点分别进行突变，最终获得热稳定性显著提高的壳聚糖酶突变体mut6。与野生型相比，本专利技术提供的壳聚糖酶突变体mut6在55℃和75℃的半衰期(t1/2)分别提高了80.17％和62.26％，显著改善了壳聚糖酶热稳定性差的问题，从而可提高壳聚糖酶的生产效率，降低生产成本，为壳寡糖的酶法制备提供了有潜力的工业应用候选酶。所述壳聚糖酶适宜应用温度为30～65℃,最适反应温度为55℃，应用ph为4.5～6.5，最适反应ph为6.0。
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1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：在野生型壳聚糖酶基础上，进行如下突变中的任意一种或几种：将第49位丙氨酸突变为甘氨酸、将第70位赖氨酸突变为丙氨酸、将第84位的丝氨酸突变为丙氨酸、将第89位的天冬酰胺突变为甘氨酸、将第199位的天冬氨酸突变为精氨酸、将第221位的天冬酰胺突变为甘氨基酸；所述野生型壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：在野生型壳聚糖酶基础上，进行如下突变：将第49位丙氨酸突变为甘氨酸、将第70位赖氨酸突变为丙氨酸、将第84位的丝氨酸突变为丙氨酸、将第89位的天冬酰胺突变为甘氨酸、将第199位的天冬氨酸突变为精氨酸、将第221位的天冬酰胺突变为甘氨基酸；所述野生型壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.编码权利要求1或2所述壳聚糖酶突变体的DNA。
4.含有权利要求3所述DNA的表达质粒。
5.含有表达权利要求1或2所述壳聚糖酶突变体对应氨基酸的核苷酸的重组质粒。
6.含有权利要求4所述表达质粒或含有权利要求5所述重组质粒的宿主微生物。p>
7.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于：利用编码权利要求1或2所述壳聚糖酶突变体的DNA替换编码野生型壳聚糖酶的DNA。
8.权利要求1或2所述壳聚糖酶在制备壳寡糖中的应用。
9.权利要求1或2所述壳聚糖酶在酶解壳聚糖中的应用。
10.根据权利要求8或9所述应用，其特征在于：所述应用温度为：30～65℃；和/或；所述应用的pH为：4.5～6.5。
...【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：在野生型壳聚糖酶基础上，进行如下突变中的任意一种或几种：将第49位丙氨酸突变为甘氨酸、将第70位赖氨酸突变为丙氨酸、将第84位的丝氨酸突变为丙氨酸、将第89位的天冬酰胺突变为甘氨酸、将第199位的天冬氨酸突变为精氨酸、将第221位的天冬酰胺突变为甘氨基酸；所述野生型壳聚糖酶的氨基酸序列如seq idno:1所示。
2.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：在野生型壳聚糖酶基础上，进行如下突变：将第49位丙氨酸突变为甘氨酸、将第70位赖氨酸突变为丙氨酸、将第84位的丝氨酸突变为丙氨酸、将第89位的天冬酰胺突变为甘氨酸、将第199位的天冬氨酸突变为精氨酸、将第221位的天冬酰胺突变为甘氨基酸；所述野生型壳聚糖酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：王刚刚，谢杰，刘京伟，王偲，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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