一种HIV-1表型耐药检测载体，其特征在于，所述载体结构如图6所示。本发明专利技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术利用位点特异重组不再需要使用限制性内切酶和连接酶，省时省力，保证目的基因正确的方向和阅读框。本发明专利技术克隆得到的入门载体可以多次使用，转移目的基因到Gateway改造过的各种表达载体。因此本项新型表型耐药检测载体一方面将大大缩短表型耐药检测时间，提高检测效率，另一方面可以为进一步HIV-1表型耐药的研究打下基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术充分利用分子克隆技术和位点重组原理，构建一个入门克隆和目的表达克隆。构成新型表型耐药检测系统。
技术介绍
艾滋病抗病毒治疗的广泛应用显著延长了患者寿命，提高了患者的生活质量，大大降低了 HIV/AIDS相关发病率和死亡率。但是HIV耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。HIV耐药不仅使患者抗病毒治疗的效果下降，甚至完全失败。HIV耐药株的出现和流行将带来严重的公共卫生问题1)耐药导致的治疗失败使艾滋病死亡病例增加；幻更换 “二线药物”导致治疗费用增加；3) HIV耐药株的传播。HIV-I耐药检测不仅可以帮助公共卫生研究人员了解耐药毒株传播现状和趋势， 以制定相应的公共卫生防治策略，还可以帮助临床医生选择有效地药物尤其是在对一线或二线药物治疗出现病毒学失败的病例，因此耐药检测无论是对耐药流行株的检测还是对艾滋病患者的关怀都是一种非常重要和有价值的方法。表型耐药检测能够直接定量评估HIV 耐药情况，而且对于非B亚型和任何新的抗病毒药耐药均可评估。然而假病毒骨架载体分子很大，传统的表型耐药检测系统很难及时有效的将RT区耐药片段置换进去，致使检测时间长，不利于临床合理治疗方案的及时制定。基于此，我们必须依托我们实验室现有条件， 专利技术出一种全新、高效和快速的HIV-I表型耐药检测系统。
技术实现思路
本专利技术目的在于构建利用位点重组HIV-I表型耐药检测载体，提高表型耐药检测效率。本专利技术的另一目的在于提供上述载体构建方法。本专利技术的专利技术思路基于下述两方面的考虑。第一，在艾滋病临床治疗工作中，表型耐药检测能够为艾滋病患者的治疗方案的制定提供重要依据。然而假病毒骨架载体分子很大传统的表型耐药检测系统很难及时有效的将RT区耐药片段置换进去，致使检测时间长， 严重影响了耐药检测原有的效果；第二，Gateway 技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。它主要是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统(attB χ attP —attL xattR)。BP和LR两个反应就构成了 Gateway 技术。BP反应利用一个attB DNA片段和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。基于上述原理，我们开发了一项新型表型耐药检测系统，它将大大缩短表型耐药检测时间，提高检测效率。为了达成本专利技术上述目的，本专利技术采用如下具体技术方案HIV-I表型耐药检测载体，所述载体结构如图6所示。所述载体的碱基序列如SEQ ID No. 3所示。一种上述的HIV-I表型耐药检测载体的构建方法，具体步骤如下(l)pcDNA6. 2gw_miR载体(invitrogen公司，结构如图1所示)重建，利用限制性内切酶BamHl和BaglII切割pcDNA6. 2gw_miR载体并重组加入gag-pol片段得到 pcDNA6. 2-gag-pol 载体，所述 pcDNA6-gag-pol 结构如图 2 所示；(2)pNL4-3载体(结构如图4所示)重建，利用Mscil限制性内切酶切割ρ NL4-3 载体，删除原有pol区，自连形成缺失pol区的载体PNL4-3-1载体，利用限制性内切酶spel 和apal切割plenti6 v5/dest (invitrogen结构如图3所示)得到ATTR片段，利用限制性内切酶spel和apal切割pNL4_3_l载体回收载体，将载体和ATTR片段定向连接，得到 PNL4-3-ATTR载体，结构如图5所示；(3)将pcDNA6. 2-gag-pol质粒和pNL4-3_ATTR质粒经BP、LR反应后最终得到质粒pNL4-3-gag-pol，结构如图6所示；(4)将上述pNL4-3-gag-pol与pcDNA3. 1-ENV质粒共转染293细胞得到假病毒，假病毒感染(ihost细胞检测荧光素酶基因表达情况。上述载体在制备HIV-I表型耐药检测试剂盒中的用途。本专利技术的有益效果本专利技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术利用位点特异重组不再需要使用限制性内切酶和连接酶，省时省力，保证目的基因正确的方向和阅读框。本专利技术克隆得到的入门载体可以多次使用，转移目的基因到(Gateway改造过的各种表达载体。因此本项新型表型耐药检测载体一方面将大大缩短表型耐药检测时间， 提高检测效率，另一方面可以为进一步HIV-I表型耐药的研究打下基础。附图说明图 1 为 pcDNA6. 2gw_miR 载体；图2 为构建的 pcDNA6. 2-gag-pol 载体；图 3 为 plenti6 v5/dest 载体结构图；图4为pNL4-3载体结构图；图5为pNL4-3-ATTR载体结构图；图6为重组pNL4-3-gag_pol载体结构图。具体实施例方式本专利技术所述新型HIV-I表型耐药检测载体是利用下述方法构建的，步骤为( 一 )基于 invitrogen 公司 gateway 重组系统的 pcDNA6· 2gw_miR 载体重建1. pcDNA6. 2-gag-l 载体构建1. IPCR 扩增 gag-Ι 片段，序列如 SEQ ID No. 1 所示。弓丨物gag-S_BamHl :tgactagcggatcctagaaggagagag-ASE-Nhel-Bgll GAGAGATCTGAGGGAAGCTAGCGGATACAG模板为pNL4_3质粒(pNL4_3为HIV-I野生株假病毒骨架质粒，GenBank编号M19921. 2) PCR 条件94°C预变性 2min，94°C变性 30s、50°C退火 30s、72°C延伸 1. 5min 循环 30次，最后72°C延伸IOmin01. 2gag-l 片段用 BamhI 和 BglII 酶切回收 gag_l 片段，插入 pcdna6. 2gw_miR载体 (invitrogen公司，结构如图1所示)(pcdna6. 2gw_miR用BamHI和BgII切割回收载体)形成pcDNA6. 2-gag-l载体序列如SEQ ID No. 2所示。2. pcDNA6. 2_gag_2 载体构建2. IPCR 扩增 gag-2 片段，序列如 SEQ ID No. 3 所示。弓丨物gag-S2_BamHl :ttttagggaggatccggccttcccacaaggag-ASE-Nhel-Bgll GAGAGATCTGAGGGAAGCTAGCGGATACAG模板为pNL4-3质粒，PCR条件94°C预变性2min，94°C变性30s、50°C退火30s、 72°C延伸0. 5min循环30次，最后72°C延伸IOmin02. 2用BamhI和BgII酶切gag_2片段回收并插入pcDNA6. 2-gag-l载体 (pcdna6. 2-gag-l 用 BglII 切割)形成载体 pcDNA6. 2-gag 载体，序列如 SEQ IDNo. 4 所示。3. pcDNA6. 2-pol-Sl 载体构建3. IPCR 扩增 pol-S本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＨＩＶ－１表型耐药检测载体，其特征在于，所述载体结构如图６所示。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈德喜，乔录新，魏飞力，张玉林，丁渭，李宁，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：11
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