结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，步骤是：A、裂解结核分枝杆菌用于PCR反应的模板；B、设计PCR引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶（pncA）基因；C、浓缩扩增的pncA基因片段并定量；D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达pncA酶；F、测定表达的pncA酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核杆菌标准敏感株和耐药株的pncA酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。其特征在于使用一对引物就能测定因pncA基因突变导致的耐药性；同时公开了即能从结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的引物序列。本发明专利技术能快速、灵敏检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，无需细菌培养。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体涉及一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的快速检测方法。可用于临床结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的快速检测。
技术介绍
结核病是对人类威胁最大的传染病之一，尽管牛型结核分枝杆菌疫苗(BCG)和各种抗结核药物在全球范围内得到了广泛应用，但近年来，随着人口流动及人口密度的增高， 结核杆菌多重耐药菌株及同人体免疫缺陷病毒(HIV)双重感染的出现，结核病已在发达国家和发展中国家呈再度肆虐态势。据报道，2005年全球大约有880万新发结核病人，每年约有160万人死于结核病。由于结核病的历史悠久，结核病的耐药状况十分严重，多重耐药和超级耐药株的出现，已成为结核病治疗中的一个难题。结核杆菌的耐药性检测，对于指导临床正确用药和有效控制结核病具有非常重要的作用。由于结核分枝杆菌的生长十分缓慢， 传统的药敏试验需要长达1 2个月时间，不能及时指导临床用药，可能使感染耐药结核的病人在该期间得不到正确的治疗。因此，快速，灵敏，特异检测结核杆菌耐药性的方法对结核病的早期诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。在目前使用的用于治疗结核病的临床药物中，吡嗪酰胺是一线抗结核药物之一。 目前临床上检测吡嗪酰胺的耐药性方法主要可以分为表型检测(细菌培养)和基因检测两类，并以前者为主。由于结核菌生长缓慢，不仅需要长达1 2个月时间，而且对吡嗪酰胺的耐药性检测需要在酸性培养基中进行，对培养基的PH值控制要求高，往往导致即使是同一实验室不同时间测定的结果也不一致。而基因检测的方法主要是测定与吡嗪酰胺耐药性产生密切相关的吡嗪酰胺酶基因(/7/7^)的位点突变。已报道的方法有基因芯片、基因测序列等方法。所有基因检测方法只能根据已经报道的与耐药性产生有相关性的突变位点来判断是否耐药。但是由于/^d基因的很多位点突变，都会导致吡嗪酰胺耐药性的产生，而且新的突变位点也在不断报道，因此，各种基因检测的结果容易产生假阴性，只能作为参考， 还需要传统药敏实验进行验证。一系列的研究表明，吡嗪酰胺耐药性产生与结核基因表达的吡嗪酰胺酶的活性丧失有90%以上的相关性，因此也有人报道通过直接测定结核分枝杆菌的吡嗪酰胺酶活性来测定结核杆菌的吡嗪酰胺耐药性。但由于结核杆菌中吡嗪酰胺酶的含量少，该方法同样需要对结核杆菌进行培养放大后才能进行，需要的时间与传统的药敏时间差不多。基于以上的原因，目前国际上还没有标准的测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法。体外蛋白质无细胞表达系统是一种以外源DNA为模板，利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质体外快速表达的系统。经常使用的有兔网织红血球(rabbit reticulocyte)、小麦胚芽(wheat germ)、大肠杆菌0 Coli)的细胞裂解液。使用兔网织红血球表达系统，日本科学家于2001年报道过一种测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法。由于兔网织红血球表达系统中，溶液为深红色，与吡嗪酰胺酶活性测定的反应产物颜色接近，需要对溶液进行脱色处理，增加了检测时间和成本，脱色不完全也会带来新的误差。该报道中，也采用了小麦胚芽表达系统，但效果不明显，检测灵敏度度比兔网织红血球差很多倍。此外，该报道中采用的PCR引物，由于部分与基因序列重合，PCR引物覆盖了部分的/Md基因突变位点，导致需要采用至少两对引物，才能对一个结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性进行完全检测，增加了检测的复杂性和成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性试剂的快速检测方法(PCR引物设计方法和引物序列)，本专利技术能快速(24小时)，灵敏，特异检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，具有操作简便，成本低，无需细菌培养等特点。其主要技术特征在于使用一对引物就能测定结核分枝杆菌因 PncA基因突变导致的耐药性。一种，其步骤是A、裂解结核分枝杆菌用于PCR反应的模板；裂解结核分枝杆菌的方法包括加热煮沸法、超声破碎法、压力法等，主要目的在于将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组.B、设计PCR引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶基因；其特征之一在于PCR引物序列根据结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列来设计，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，能完整反应全长/^d基因。其特征之二在于PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子。C、浓缩扩增的/Md基因片段并定量；浓缩方法包括乙醇沉淀法、吸附提取法等；定量方法包括紫外吸收法、荧光定量法等。主要目的在于控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量。D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶；表达时间可以根据需要调节， 一般I-M小时。F、测定表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。 测定吡嗪酰胺酶活性的方法一般采用硫酸亚铁胺法，通过吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质显色。也可以采用其它如分光光度计、高效液相色谱法等来测定吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性。所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，增强表达子为5’端非编码区增强子和/或3’端非编码区增强子。本专利技术所述的即能从结核杆菌基因组上扩增全长基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子的引物对序列。引物对Pl 上游引物序列5’ -T AATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACGTAAGGAGGAC-3，(SEQ NO. 1)，下游引物序列5，-GCCGCC AACAGTTCATCCCGGT-3’ (SEQ NO. 2)。所述的即能从结核杆菌基因组上扩增全长基因适合小麦胚芽无细胞表达系统增强表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子和5’端非编码区增强子的引物对序列引物对P2 列举三套包含不同5’端非编码区增强子的上游引物序列5’-TAATACGACTCACTATAGGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATT ACTATTTACAATTACACCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，(SEQ NO. 3)；或5’-TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACT CCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，(SEQ NO. 4)；或5’-TAATACGACTCACTATAGGGATTGTGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCACTGATCTCTTGTTAG ATCTTTTTATAATCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，(SEQ NO. 5)； 下游引物序列5，-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3，(SEQ NO. 6)。通过采用本专利技术提供的以上方法和PCR引物，就可以在M小时内实现对结核杆菌吡嗪酰胺耐药性检测。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果与传统的表型检测相比，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，其步骤是：Ａ、裂解结核分枝杆菌用于ＰＣＲ反应的模板；裂解结核分枝杆菌的方法包括加热煮沸法、超声破碎法、压力法，将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组；Ｂ、设计ＰＣＲ引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶基因；在于ＰＣＲ引物序列根据结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列来设计，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，完整反应全长ｐｎｃＡ基因，在于ＰＣＲ引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；Ｃ、浓缩扩增的ｐｎｃＡ基因片段并定量；浓缩方法包括乙醇沉淀法、吸附提取法；定量方法包括紫外吸收法、荧光定量法，在于控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量；Ｄ、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶；表达时间调节１－２４小时；Ｆ、测定表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，测定吡嗪酰胺酶活性的方法采用硫酸亚铁胺法，通过吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质显色，采用高效液相色谱法来测定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：危宏平，周满，王殿冰，张治平，张先恩，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83