【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微酸响应型仿生纳米囊泡及其制备方法，以及其在制备肿瘤全身治疗药物中的应用。
技术介绍
1、肝癌是全球第四大癌症相关死亡原因，其中肝细胞癌(hcc)约占原发性肝癌的90％。早期肝细胞癌可接受根治性手术干预或消融治疗，而晚期或侵袭性肝细胞癌的患者必须接受全身治疗，包括基于酪氨酸激酶抑制剂(tkis)的靶向治疗和使用免疫检查点抑制剂(icis)的免疫治疗。但由于肝癌实体瘤微环境中存在诸多因素相互交联的免疫逃避网络，当前单药全身肿瘤治疗策略效果有限，多药联合方案成为晚期肝细胞癌治疗的趋势。
2、现阶段，pd-l1抑制剂阿替利珠单抗联合血管生成抑制剂贝伐珠单抗的组合治疗已取代经典的索拉非尼单药治疗，成为晚期肝细胞癌的一线治疗药物。然而，这两种抑制剂都是单克隆抗体(mab)，受单克隆抗体固有的性质所限，这种联合治疗的临床应用仍面临挑战。首先，单克隆抗体分子量高，这使得它们在体内较难被清除，从而增加了潜在的免疫反应风险，单克隆抗体的半衰期通常较长，这意味着它们在体内停留的时间较长，从而增加了发生免疫反应的时间和可能性，单克隆抗体在设计和生产过程中可能存在一些问题，例如靶点选择不当、亲和力过高等，这些问题可能导致它们与体内其他正常细胞或组织发生作用，从而引发免疫相关不良事件，这使得能使用单克隆抗体的患者的纳入标准较高，获益人群有限；其次，单克隆抗体生产的复杂性，带来了高昂的治疗成本，加剧了患者的经济负担。因此，在最近的临床研究中，人们越来越倾向于使用同样有效但更经济的小分子抑制剂，比如小分子抗肿瘤血管生成抑制剂：阿
技术实现思路
1、本专利技术目的在于借助纳米技术的优势，改善现有技术的缺陷，提供一种同时静脉递送抗血管生成小分子抑制剂阿帕替尼和pd-1蛋白的微酸响应型仿生纳米囊泡的制备方法和应用，以解决小分子抑制剂与大分子抗体联用时的生物利用度低、易耐药毒、副作用大等缺点。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、一种微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1，由生物细胞膜和载药纳米粒的混合物构成，粒径60～70nm，所述生物细胞膜表面转配有程序性死亡受体1(pd-1)，所述载药纳米粒包括聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物和其内部负载抗血管生成小分子抑制剂。
4、所述载药纳米粒是由聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物与抗血管生成小分子抑制剂通过微乳液法形成的微酸响应纳米颗粒；微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1还包括通过冰浴超声包覆在所述载药纳米粒外层的生物细胞膜，所述的生物细胞膜来源于工程化293ft细胞株的生物细胞膜，且生物细胞膜表面表达有pd-1蛋白。
5、所述抗血管生成小分子抑制剂为阿帕替尼。所述聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物和抗血管生成小分子抑制剂质量比为10：1。
6、所述的生物细胞膜总蛋白与载药纳米粒质量比为1.5：1。
7、所述的生物细胞膜的制备方法包括：
8、步骤1.将如实施例1中所示的编码pd-1蛋白的基因序列插入到pcdh-cmv-puro空载质粒中，获得重组质粒；
9、步骤2.使用293ft细胞对重组质粒进行慢病毒包装，浓缩病毒液感染293ft细胞，并加入polybrene增强感染效率，用抗性药物puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养，收集细胞，用细胞膜和细胞蛋白抽提试剂盒提取pd-1细胞膜，使用蛋白质定量bca法进行总蛋白定量。
10、微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1的制备方法，其特征在于，由如下方法构建获得：
11、(1)制备所述生物细胞膜；
12、(2)聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物的制备：以mpeg-oh 2000为原料，将其与烯丙酰氯反应，得到中间产物再向中间产物中加入试剂4,4-三亚甲基二哌啶和1,4-丁二醇二丙稀酸酯，经迈克尔加成反应得到聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物：peg-paes，分子量为11025da；
13、(3)将peg-paes溶解在无水二氯甲烷中，阿帕替尼溶解在dmso中；将二者以peg-paes和阿帕替尼的质量比为10：1混合，并分散于depc水中，经超声乳化、旋蒸以及透析获得纯化的微酸响应载药纳米颗粒：apa-ppnp；
14、(4)所述生物细胞膜通过超声使其破碎，apa-ppnp与所述生物细胞膜以质量比1：1.5冰浴超声1～2分钟，最后收集产物，通过超滤并洗涤获得apa-ppnp@mpd-1纳米囊泡；所述生物细胞膜质量以总蛋白质量计。
15、聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物包含了亲水片段聚(乙烯)乙二醇((poly(ethylene glycol)，peg)，以及酸响应片段聚(β-氨基酯)(poly(β-aminoesters)，paes)，其在中性环境下为疏水性，从而形成纳米颗粒体系将药物载于内部，而在肿瘤微酸环境下，可发生质子化，由疏水性转变为亲水性，导致纳米颗粒破裂，释放出所负载的药物。
16、本专利技术中的微酸响应嵌段聚合物peg-paes与阿帕替尼按照一定的比例混合，经超声乳化、旋蒸和透析后得到微酸响应纳米颗粒(apa-ppnp)。从293ft细胞中提取含有pd-1的细胞膜，按照一定比例与apa-ppnp共混后，通过冰浴超声处理获得细胞膜涂层的微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1。该囊泡可以在弱酸性肿瘤微环境中解体，释放出阿帕替尼，抑制肿瘤血管生成，同时阻断pd-1/pd-l1免疫抑制通路，增强肿瘤免疫治疗。
17、本专利技术中，将微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1作为递送平台，实现小分子阿帕替尼与pd-1大分子蛋白的联合递送，实现两种抑制剂的协同增效，制备成为肿瘤治疗的药物组合物，发挥抗肿瘤效果。
18、本专利技术提供了一种小分子抑制剂和大分子抑制剂联合给药新剂型及其制备方法和应用。提供了一种阿帕替尼和pd-1蛋白酸响应递送纳米系统，用于肝细胞癌的治疗。该递送系统包括：抑制剂、酸响应材料以及仿生细胞膜。抑制剂为以小分子阿帕替尼为代表抗血管生成抑制剂与另一种以pd-1蛋白为代表的抗肿瘤免疫检查点抑制剂；酸响应材料包括聚-β氨基酯等具有酸响应能力的材料的一种或多种；仿生细胞膜为能够稳定表达免疫检查点相关蛋白的细胞株的细胞膜成分。本专利技术的微酸响应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1，其特征在于，由生物细胞膜和载药纳米粒的混合物构成，粒径60～70nm，所述生物细胞膜表面转配有程序性死亡受体1(PD-1)，所述载药纳米粒包括聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物和其内部负载抗血管生成小分子抑制剂。
2.如权利要求1所述的微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1，其特征在于，所述的生物细胞膜来源于基因工程化293FT细胞株，且生物细胞膜表面表达有PD-1蛋白。
3.如权利要求1所述的微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1，其特征在于，所述抗血管生成小分子抑制剂为阿帕替尼。
4.如权利要求1所述的微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1，其特征在于，所述聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物和抗血管生成小分子抑制剂质量比为10：1。
5.如权利要求1所述的微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1，其特征在于，所述的生物细胞膜总蛋白与载药纳米粒质量比为1.5：1。
6.如权利要求1～
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的生物细胞膜总蛋白与载药纳米粒的质量比为1.5：1。
8.权利要求1～5任一项所述的微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1在制备肿瘤治疗药物中的应用。
9.权利要求1～5任一项所述的微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1在制备肿瘤免疫检查点抑制剂中的应用。
10.权利要求1～5任一项所述的微酸响应型仿生纳米囊泡Apa-PPNP@mPD-1在制备肿瘤血管生成抑制药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1，其特征在于，由生物细胞膜和载药纳米粒的混合物构成，粒径60～70nm，所述生物细胞膜表面转配有程序性死亡受体1(pd-1)，所述载药纳米粒包括聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物和其内部负载抗血管生成小分子抑制剂。
2.如权利要求1所述的微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1，其特征在于，所述的生物细胞膜来源于基因工程化293ft细胞株，且生物细胞膜表面表达有pd-1蛋白。
3.如权利要求1所述的微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1，其特征在于，所述抗血管生成小分子抑制剂为阿帕替尼。
4.如权利要求1所述的微酸响应型仿生纳米囊泡apa-ppnp@mpd-1，其特征在于，所述聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)两亲性嵌段共聚物和抗血管生成小分子抑制剂质量比...
【专利技术属性】
技术研发人员：闵娟，张钰婷，杜安娜，许碧超，张磊，张配，魏明瑜，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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