提供用于通过基因扩增法扩增UGT1A1基因中含有检测目标部位的目标区域的引物对，该引物对可以特异性扩增前述区域。使用3对引物对，各个引物对分别包含含有序列号4或序列号81、序列号21和序列号42的碱基序列的正向引物、和含有序列号13或序列号91、序列号29和序列号48的碱基序列的反向引物。通过使用这种引物对，可以在同一反应液中，同时扩增UGT1A1基因的分别含有3种多态性(UGT1A1*6，UGT1A1*27，UGT1A1*28)发生部分的3个目标区域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于扩增UGTlAl基因的引物对，含有该引物对的UGTlAl基因扩增用试剂及其用途。
技术介绍
已知葡糖醛酸转移酶(UDP-葡糖醛酸基转移酶UGT)是一种已知的药物代谢酶， 是一种催化将葡糖醛酸结合到药物、异物、作为内源性物质的胆红素、留类激素、胆汁酸等上的反应的酶。已报道了 UGT有被分类为UGTl家族和UGT2家族的多种同工酶。这些同工酶中，编码属于UGTl家族的UGTlAl的基因(UGT1A1基因)存在基因多态性，一般而言认为这与抗癌剂盐酸伊立替康(Irinotecan)的副作用的表现相关。具体而言，据报道，患者UGTlAl基因具有多态性时，通过UGT将具有高抗肿瘤活性的伊立替康水解物(SN-38) 解毒的能力下降，因而发生白血球减少和腹泻等严重的副作用。与这种副作用相关的代表性的基因多态性已知有启动子区域的多态性UGT1A1*28，外显子1的多态性UGT1A1*6 和UGT1A1*27。尤其是据报道包括日本人在内的亚洲人中，由于除了最重要的多态性 UGT1A1*28，还同时具有多态性UGT1A1*6和UGT1A1*27的至少一种，因而容易出现更强的副作用。另外，UGTlAl由于与生物体内的由葡糖醛酸产生的结合胆红素相关，因此其多态性也是吉伯综合症等体质性黄疸的成因。因此，研究UGTlAl基因的多个多态性对于预测抗癌剂所产生的副作用的程度，预测副作用的发生十分重要。另一方面，作为在基因水平分析所有疾病的成因、个体间疾病易感性(容易患病性)、个体间药效差异等的方法，现在广泛使用点突变，即所谓单核苷酸多态性(SNP)的检测。作为点突变的一般的检测方法，可以列举(1)对于试样的目标DNA，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增相当于检测对象序列的区域，分析其全基因序列的直接测序(Direct Sequencing)法，(2)对于试样的目标DNA，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增相当于检测对象序列的区域，用根据前述检测对象序列有无目标突变而切断作用不同的限制酶将其扩增产物切断，通过电泳进行分型的RFLP分析，(3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行 PCR,通过扩增的有无来判断突变的ASP-PCR法等。但是，这些方法例如由于必须纯化从试样中提取的DNA、电泳、限制酶处理等，因此麻烦又费钱。而且，进行PCR后，反应容器需要开封一次，因此就存在前述扩增产物混入下一个的反应体系中，分析精确度降低的担忧。而且，由于难以自动化，因此无法分析大量试样。而且，就前述(3)的ASP-PCR法而言，也存在特异性低的问题。从这些问题出发，近年来，作为点突变的检测方法，分析由目标核酸与探针形成的双链核酸的融解温度(Tm :melting temperature)的方法正得到实际的应用。这种方法由于通过例如Tm分析或者前述双链的融解曲线的分析来进行，因此被称为融解曲线分析。其就是以下这种方法。即，首先，使用与含有检测目标的点突变的检测对象序列互补的探针， 使检测试样的目标单链DNA与前述探针形成杂交体(双链DNA)。然后，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的变动来检测伴随温度上升的杂交体的解离(融解)。然后， 基于该检测结果确定Tm值，由此判断是否存在点突变。杂交产物的同源性高，则Tm值高， 同源性低，则Tm值低。因此，预先求出含有点突变的检测对象序列和与之互补的探针的杂交产物的Tm值(评价基准值)，再测定检测试样的目标单链DNA和前述探针的Tm值(测定值)。如果前述测定值与评价基准值程度相同，则可以判断为匹配，即在目标DNA中存在点突变，如果测定值比评价基准值低，则可以评断为不匹配，即在目标DNA中不存在点突变。 而且，通过该方法可以实现基因分析的自动化。但是，对于这种利用Tm分析的检测方法而言，存在着在PCR中必须要特异性且高效地扩增含有检测目标部位的区域的问题。尤其是，由于UGT存在许多同工酶，编码这些酶的序列又极为类似，因此就有这样的担忧，即在PCR中连UGTlAl之外的同工酶的编码基因也被扩增。而且，这种连UGTlAl之外的同工酶的编码基因也被扩增的情况，也成为例如 UGTlAl基因的特定多态性(UGT1A1*28，UGT1A1*6或UGT1A1*27)分析(非专利文献1)中， 分析结果的可信度降低的原因。而且，这样一来，由于分析1个样本时伴随过多劳动力，因此存在着实际上不能实现大量分析试样的问题。非专利文献PMID:11156391 Cancer Res. 2000 Dec 15 ；60 (24) :6921_6。
技术实现思路
因此，本专利技术以提供用于通过基因扩增法特异性扩增UGTlAl基因的目标区域的引物对作为目的。为了实现上述目的，本专利技术的引物对，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增 UGTlAl基因的引物对，且含有选自以下引物对(1) (3)所组成的组中的至少一种。引物对(1)包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对(Fl)与含有序列号1的碱基序列的UGTlAl基因中的、以第2120位的腺嘌呤碱基 (A)作为第1个碱基朝着5’方向直至第18 22个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述腺嘌呤碱基(A)作为3’末端和与含有序列号1的碱基序列的UGTlAl基因中、以第2140位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着5’方向直至第18 34个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端中的至少一个(Rl)与含有序列号1的碱基序列的UGTlAl基因中的、以第2226位的鸟嘌呤碱基 (G)作为第1个碱基朝着3’方向直至第17 27个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸， 该寡核苷酸以与所述第2226位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端和与含有序列号1的碱基序列的UGTlAl基因中的、以第2198位的胞嘧啶碱基(C) 作为第1个碱基朝着3’方向直至第22 39个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第2198位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端中的至少一个引物对(2)包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对(F2)与含有序列号1的碱基序列的UGTlAl基因中的、以第2622位的鸟嘌呤碱基 (G)作为第1个碱基朝着5’方向直至第15 27个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端(R2)与含有序列号1的碱基序列的UGTlAl基因中的、以第2687位的胞嘧啶碱基 (C)作为第1个碱基朝着3’方向直至第17 26个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸， 该寡核苷酸以与所述第2687位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端引物对(3)包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对(F3)与含有序列号1的碱基序列的UGTlAl基因中的、以第1863位的胞嘧啶碱基 (C)作为第1个碱基朝着5’方向直至第17 31个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端(R3)与含有序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种探针，其特征在于，其为用于检测ＵＧＴ１Ａ１基因的多态性的探针，其由下述（３）的寡核苷酸构成，（３）与序列号１中的、以第１８９２位的胞嘧啶碱基（Ｃ）作为第１个碱基，朝着３’方向直至第２５～３１个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶碱基作为３’末端。
【技术特征摘要】
2006.11.30 JP 2006-322955;2007.09.07 JP 2007-232611.一种探针，其特征在于，其为用于检测UGTlAl基因的多态性的探针， 其由下述(3)的寡核苷酸构成，(3)与序列号1中的、以第1892位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第25 31个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶碱基作为3’末端。2.根据权利要求1所述的探针，所述寡核苷酸(3)为序列号67 73中的任意一种寡核苷酸。3.根据权利要求2所述的探针，所述寡核苷酸(3)为序列号69的寡核苷酸。4.根据权利要求1所述的探针，所述探针为荧光标记探针。5.一种试剂，其特征在于，其为用于检测UGTlAl基因的多态性的试剂，含有权利要求1 所述的探针。6.根据权利要求5所述的试剂，其还含有由下述(2-1)的寡核苷酸构成的探针和由下述(2-2)的寡核苷酸构成的探针中的至少一种，(2-1)与序列号1中的、以第2645位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第15 22个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶碱基作为3’末端， 禾口(2-2)与序列号1中的、以第2625位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第17 22个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤碱基互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端。7.根据权利要求6所述的试剂，所述(2-1)的寡核苷酸为序列号59 66中的任意一种寡核苷酸，所述(2-2)的寡核苷酸为序列号100 105中的任意一种寡核苷酸。8.根据权利要求7所述的试剂，所述(2-1)的寡核苷酸为由序列号62的碱基序列构成的寡核苷酸，所述(2-2)的寡核苷酸为序列号102的寡核苷酸。9.根据权利要求5所述的试剂，所述探针为荧光标记探针。10.一种多态性分析方法，其特征在于，其为分析UGTlAl基因中的检测对象部位的多态性的方法，包括以下步骤(i) (iv)(i)以试样中的核酸为模板，在反应液中扩增UGTlAl基因中包含检测对象部位的区域的步骤；( )准备含有所述步骤⑴中的扩增产物和权利要求5所述的试剂的反应液的步骤；(iii)改变所述反应液的温度，测定所述扩增产物和所述试剂中的探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤；(iv)根据伴随温度变化的所述信号值的变动，决定所述检测对象部位的多态性的步马聚ο11.根据权利要求10所述的多态性解析方法，在所述(i)步骤中，在扩增反应之前，向所述反应液中添加权利要求5所述的试剂。12.根据权利要求10所述的多态性解析方法，所述试样为生物体试样。13.根据权利要求12所述的多态性解析方...
【专利技术属性】
技术研发人员：平井光春，间岛智史，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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