一种环境中雄激素的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种环境中雄激素的检测方法，是用黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子连接荧光素酶报告基因载体，构建报告质粒，将报告质粒、黄鳝雄激素受体表达质粒和内参质粒共转染LbetaT2细胞，用待测样品刺激转染后的LbetaT2细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中的雄激素。本发明专利技术的检测方法重复性好、灵敏度高，检测结果可靠，且操作简单方便，可广泛应用于环境中的雄激素检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及环境生物
，具体涉及。
技术介绍
环境激素是环境中存在的能够像激素一样影响人体内分泌功能的化学物质的总称。环境性类固醇激素由于在自然界食物链中可富集，难以降解和失活等特点，会严重破坏生物体正常的激素生理活动。环境雄激素可与雄激素受体(AR)结合，从而模拟雄激素活性， 发挥雄激素作用。环境性类固醇激素对人类生殖健康的影响已经引起人们的广泛关注，建立一套快速、有效、准确的筛检测试环境性类固醇激素的方法已经成为当务之急。目前有关环境雄激素污染的监测已有研究，测评环境雄激素的方法有 Hershberger试验、青春期雄鼠试验等、雄激素受体结合试验、雄激素依赖细胞增殖筛选试验、雄激素依赖基因转录试验等(张国军.环境抗雄激素检测方法.国外医学.卫生学分册；Foreign Medical Sciences-hygine，2003年02期)。国内有学者应用雄激素配体-受体结合特性，开发了一种环境类雄激素的ELISA定量检测方法(专利编号200910191914. X)。但这些方法都比较繁琐，特别是基于雄激素受体_配体结合的方法不能准确反应激素的生物学活性，难以可靠地对环境中雄激素进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中的不足，提供。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的本专利技术的技术方案是利用黄鳝脑芳香化酶基因垂体中特异启动子受雄激素上调的特点，建立一种通过检测雄激素对上述启动子的激活情况，实现对环境雄激素进行检测的方法。，是用黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子(该启动子仅在黄鳝垂体中起作用)连接荧光素酶报告基因载体，构建报告质粒，将报告质粒、黄鳝雄激素受体表达质粒和内参质粒共转染LbetaT2细胞(小鼠垂体促性腺激素细胞)，用待测样品刺激转染后的LbetaT2细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中的雄激素。所述黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子序列如SEQ ID NO: 1所示。所述荧光素酶报告基因载体为pGL3-BasiC。所述内参质粒为pRL-TK (海肾荧光素酶对照报告质粒)，作为转染实验的内参照， 可以避免因转染效率的差异对结果的影响。所述共转染LbetaT2细胞所用试剂为Lipofectamine 2000 (该试剂转染效率较高)，且转染后在无酚红高糖DMEM培养基中培养4-6小时后，更换新的培养基再培养22-26 小时。所述用待测样品刺激转染后的LbetaT2细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中雄激素，是在样品刺激后22-26小时再检测荧光素酶活性。所述样品中的雄激素为二氢睾酮，其他雄激素的作用机制与二氢睾酮相同，本专利技术的方法也可以用于检测其他种类的雄激素。pGL3-BasiC萤火虫荧光素酶报告基因载体是本领域技术人员经常使用的一种荧光酶检测系统，pGL3-Basic载体不含启动子及增强子，将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游，就可以测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。黄鳝雄激素受体表达质粒是黄鳝本身的受体，更适合于黄鳝基因启动子活性分析。本专利技术将黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子序列亚克隆至pGL3-BasiC载体萤火虫荧光素酶基因上游，从而构建一个报告质粒。因为黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子序列上含雄激素反应元件(ARE，雄激素反应元件核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示)，因此能特异地对雄激素刺激产生反应。将上述构建好的报告质粒、黄鳝雄激素受体表达质粒以及内参质粒(pRL-TK)共转染LbetaT2细胞，在无酚红高糖DMEM (Gibco，含10%无激素胎牛血清)培养基中培养4_6 小时后，更换新的培养基再培养22-26小时后，用待测样品对转染后的LbetaT2细胞进行刺激，刺激后22-26小时检测荧光素酶活性。根据荧光素酶活性是否明显升高可以检测待测环境样品的雄激素活性物质的存在。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术利用黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子受雄激素上调的特殊性，通过检测雄激素对这种启动子的激活情况而检测环境性激素的存在。采用的技术方案基于检测雄激素的生物学活性，结果可靠，重复性好，灵敏度高，且操作简单方便。附图说明图1为实施例1中黄鳝脑芳香化酶垂体特异启动子活性对雄激素二氢睾酮DHT的剂量反应曲线。EBAPII为黄鳝脑芳香化酶垂体特异启动子报告质粒；AREtk为阳性对照质粒。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步地描述，但具体实施例并不对本专利技术做任何限定。实施例1黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，为申请人自己克隆，已经在网上公布。本实施例采用Promega公司的pGL3-BasiC萤火虫荧光素酶报告基因载体。本专利技术将上述黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子序列亚克隆至pGL3-BasiC载体萤火虫荧光素酶基因上游，常规方法构建一个报告质粒，命名为EBAPI。将LbetaT2细胞(本实施例由美国加州大学圣地亚哥分校的Pamela Mellon 博士赠予，市面上可以购买)转移至24孔板(每孔IO5细胞)，然后采用Invitrogen的 Lipofectamine 2000 (Ιμ 7孔)把报告质粒(380 ng)、黄鳝雄激素受体表达质粒(50 ng，自己构建，将黄鳝雄激素受体cDNA编码区克隆到Invitrogen公司的pcDNA3. 0表达载体中)、以及Promega公司的内参质粒pRL-TK (20 ng)共转染到LbetaT2细胞中，在无酚红高糖 DMEM (Gibco，含10%无激素胎牛血清)培养基中培养4小时后，更换新的培养基再培养24 小时后，用待测样品(本实施例中为环境水样，经过除菌处理)对转染细胞进行刺激，刺激后 24小时裂解细胞，采用双萤光素酶报告基因检测系统(Promega)测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性是否升高就可以检测待测环境样品的雄激素活性物质的存在。本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种环境中雄激素的检测方法，是用黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子连接荧光素酶报告基因载体，构建报告质粒，将报告质粒、黄鳝雄激素受体表达质粒和内参质粒共转染ＬｂｅｔａＴ２细胞，用待测样品刺激转染后的ＬｂｅｔａＴ２细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中的雄激素。

【技术特征摘要】
1.一种环境中雄激素的检测方法，是用黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子连接荧光素酶报告基因载体，构建报告质粒，将报告质粒、黄鳝雄激素受体表达质粒和内参质粒共转染LbetaT2细胞，用待测样品刺激转染后的LbetaT2细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中的雄激素。2.根据权利要求1所述环境中雄激素的检测方法，其特征在于所述黄鳝脑芳香化酶基因垂体特异启动子序列如SEQ ID NO: 1所示。3.根据权利要求1所述环境中雄激素的检测方法，其特征在于所述荧光素酶报告基因载体为 pGL3_Basic。4.根据权利要求1所述环境中雄激素的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利红，张燊，张扬，张为民，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81