一种分子生物技术领域的利用环化RNase?H检测基因多态性SNP位点的方法，利用转肽酶Sortase?A将线性的RNase?H环化、具有茎环结构的探针、待测DNA片段、待测DNA特异性的正向引物与反向引物、Vent?DNA聚合酶、环化的APERNase?HII，测定待测DNA片段特定位点的SNP，提高了RNase?H的热稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种分子生物
的方法，具体是一种。
技术介绍
单核苷酸多态性SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异而导致的基因序列的多态性。SNP在基因组中分布相当广泛，近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。SNP在高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究方面具有重要的应用价值。目前，已开发了多种SNP的检测技术。但是现有SNP检测技术或是操作过程繁琐[BioTechniques，2009，46 :201-208]，或灵敏度差[BMC Genomics 2010,11 :641]，或需要昂贵的检测设备[Nucleic Acides Research, 2003, Vol. 31， No. 7e37]，或检测成本过高[BMC Genomics, 2006, 7 :291-291]。RNase H具有识别DNA与RNA杂合双链中错配碱基的特性。(1)当杂合双链完全匹配时，RNase H能够识别杂合双链中的碱基并切割杂合双链；( 当杂合双链中含有错配碱基时，RNase H不能识别杂合双链中的碱基，不能切割杂合双链。利用RNase H这一特殊的酶学特性结合PCR技术可以快速、精确地对SNP位点进行检测。但是，线性RNase H的缺点是在PCR较高的反应温度下往往变得不稳定甚至失活。而蛋白质环化后在生物学活性未受影响的同时其热稳定性得到提高的报道[Rev. Biochem. 2003,72,249-289]为提高RNase H的稳定性提供了重要依据。转肽酶Sortase A具有环化蛋白质的功能。在线性蛋白质在N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG时，在转肽酶Sortase A的作用下会将线性的蛋白质环化[JBC, 2009, M901752200]。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提供一种，利用转肽酶Sortase A将线性的RNase H环化、具有茎环结构的探针、待测DNA片段、待测DNA特异性的正向引物与反向引物、Vent DNA聚合酶、环化的APE RNase HII，测定待测DNA片段特定位点的SNP，提高了 RNase H的热稳定性。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术包括以下步骤步骤一、纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶SortaseA识别序列的线性APE RNase HII，具体步骤包括1. 1)设计特异引物对表达载体pTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I 前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸；突变正向引物ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGGAGGCGGCCGCAAA突变反向引物CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTCCGTTGTGTAC1. 2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG ；正向引物GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG反向引物GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAACTCGTCC1. 3)选取突变载体pTWIN中双酶切位点Not I\Bam H I，构建含有Sortase A识别序列的蛋白质亚克隆；1. 4)利用表达的线性融合蛋白质N端含有的CBD标签，通过几丁质纯化柱，非变性纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列LPXTG的线性蛋白质，贮存于标准贮存缓冲液中；所述的标准贮存缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl且pH 8. O。步骤二、环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HII 转肽酶Sortase A与线性的APE RNase HII在标准反应缓冲液并温浴Mh。所述的标准反应缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl和IOmM CaCl2且口!1 8. O。所述的转肽酶SortaseA与线性的APE RNase HII的浓度比为1 1的比例。所述的温浴为37 °C。步骤三、鉴定环化RNase H的热稳定性。环化的RNase H与未环化的RNase H经不同的温度加热处理后，鉴定其酶学活性。步骤四、合成具有茎环结构的两端含有荧光基团及淬灭基团的探针，其结构的特征是探针5’末端及3’末端为互补序列，剩余的探针序列与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸配对；步骤五、设计合成用于扩增目的DNA的特异性正向引物和反向引物，PCR扩增目的 DNA，正向引物GCTCCCACTCCATGAGGTATT反向引物GGGACAAGGGTCTCGGAGT所述的PCR 扩增中 PCR 反应条件为 94 C X 5min ； (94 C X 30s, 50 C X 30s, 72°C X 15s) X30循环；72°C X^iiin，扩增后的DNA片段，经胶回收纯化贮存。步骤六、利用合成的探针及环化的RNase H，在乂印011印Ius仪上进行PCR反应，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性，具体步骤包括6. 1)配制反应混合溶液20 μ L0将反应所需的酶环化的RNase H、Vent DNA聚合酶，底物探针、待测DNA片段，特异正向/反向引物，buffer, DEPC H2O, dNTP等混合均勻， 除气泡。6. 2)反应溶液转移至Mepon印Ius仪进行反应，同时检测DNA的单核苷酸多态性。本专利技术与现有的SNP检测技术相比，主要优势如下(1)操作简单方便，可以进行高通量的检测；(2)结果快速准确，数据直观，易于分析；(3)检测设备简单，不需要昂贵的检测仪器。本专利技术可以检测各种生物样本的SNP。附图说明图1是蛋白质环化的示意图。图2是环化APE RNase HII的实施例示意图。图3是提高APE RNase HII热稳定性的实施例示意图。图4是Real-time PCR检测SNP位点的示意图。图5是环化APE RNase H II RNase H在检测SNP位点中的实施例示意图。 图6是环化GFP蛋白的电泳实施例示意图。图7是环化GFP蛋白热稳定性的实施例示意图。 图8是环化GFP与未环化GFP的Tm值比较分析实施例示意图。具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1人类白细胞抗原(HLA)第274位核苷酸种类的鉴定本实施例中的，待测SNP位点为人类白细胞抗原HLA第274位核苷酸种类，环化的 RNaseH为APE RNase HII，实施例探针为与待测DNA匹配的C探针及错配的U探针。第一步，纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶SortaseA识别序列的线性APE RNaseHII，具体步骤包括1. 1)设计特异引物对表达载体pTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I 前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸；1. 2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG ；1. 3)选取突变载体pTWIN中本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用环化ＲＮａｓｅ Ｈ检测基因多态性ＳＮＰ位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、纯化Ｎ端含有寡聚甘氨酸、Ｃ端含有转肽酶Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ识别序列的线性ＡＰＥ ＲＮａｓｅＨＩＩ；步骤二、环化Ｎ端含有寡聚甘氨酸、Ｃ端含有识别序列的线性ＡＰＥ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ：转肽酶Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ与线性的ＡＰＥ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ在标准反应缓冲液并温浴２４ｈ；步骤三、鉴定环化ＲＮａｓｅ Ｈ的热稳定性，环化的ＲＮａｓｅ Ｈ与未环化的ＲＮａｓｅ Ｈ经不同的温度加热处理后，鉴定其酶学活性；步骤四、合成具有茎环结构的两端含有荧光基团及淬灭基团的探针，探针５’末端及３’末端为互补序列，剩余的探针序列与待测单链ＤＮＡ的ＳＮＰ位点两侧核苷酸配对；步骤五、设计合成用于扩增目的ＤＮＡ的特异性正向引物和反向引物，ＰＣＲ扩增目的ＤＮＡ；步骤六、利用合成的探针及环化的ＲＮａｓｅ Ｈ，在Ｓｔｅｐｏｎｅｐｌｕｓ仪上进行ＰＣＲ反应，测定待测单链ＤＮＡ待测位点的单核苷酸多态性。
【技术特征摘要】
1.一种利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一、纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A识别序列的线性APE RNaseHII ；步骤二、环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HII 转肽酶 Sortase A与线性的APE RNase HII在标准反应缓冲液并温浴Mh ；步骤三、鉴定环化RNase H的热稳定性，环化的RNase H与未环化的RNase H经不同的温度加热处理后，鉴定其酶学活性；步骤四、合成具有茎环结构的两端含有荧光基团及淬灭基团的探针，探针5’末端及3’ 末端为互补序列，剩余的探针序列与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸配对；步骤五、设计合成用于扩增目的DNA的特异性正向引物和反向引物，PCR扩增目的DNA ；步骤六、利用合成的探针及环化的RNase H，在M^on印Ius仪上进行PCR反应，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性。2.根据权利要求1所述的利用环化RNaseH检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的第一步具体步骤包括1. 1)设计特异引物对表达载体PTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸，其中突变正向引物ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGG AGGCGGCCGCAAA突变反向引物CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTC CGTTGTGTAC1.2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶SortaseA的识别序列LPXTG，其中正向引物GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG 反向引物GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAA CTC GTCC1.3)选取突变载体pTWIN中双酶切位点NotI\Bam H I，构建含有Sortase A识别序列的蛋白质亚克隆；1. 4)...
【专利技术属性】
技术研发人员：张琳，候敬丽，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31
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