本发明专利技术公开了一种鉴定miRNA靶基因的试剂盒及其应用。本发明专利技术报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用；试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用；载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用；所述报告载体，包括报告基因和分别位于所述报告基因上下游的启动子及多克隆位点；所述报告基因为萤火虫荧光素酶的编码基因。本发明专利技术的实验证明，本研究设计了miRNA靶基因鉴定的双报告基因载体系统，用于miRNA研究中的调控靶基因快速鉴定和对miRNA表达调控进行评价。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种鉴定miRNA靶基因的试剂盒及其应用。
技术介绍
在动植物基因组中广泛存在一类非编码蛋白的RNA基因，产生长度大约为18-25 个核苷酸的RNA，它们被命名为miRNA (microRNA)，它们可通过转录后水平或翻译水平调节基因表达。参与调节细胞的发育、神经分化、细胞增殖、凋亡和脂肪代谢等过程。miRNA的初级转录产物pri_miRNA可被RNase III加工成miRNA的前体 pre-miRNA,在胞核内形成的pre-miRNA可穿过核膜从胞核进入胞液，被RNaseIII类核酸酶切割形成21nt的单链miRNA，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA进入RISC复合体，调控基因表达。可降解与其完全配对的靶RNA，或抑制不完全配对的mRNA的翻译。在对miRNA调控活性的研究中，靶基因mRNA3'非翻译区(Untranslated Regions,UTR)连接于荧光素酶 (Luciferase)下游。通过萤火虫荧光素酶的活性分析，可获得miRNA对潜在靶标基因调控作用的结果。表达克隆转录后形成萤火虫荧光素酶ORF与3’ UTR的嵌合体mRNA，如果有特异的miRNA可与3 ‘ -UTR某段序列互补结合，嵌合体中荧光素酶ORF所编码蛋白的活性也相应受到调控，因此通过检测荧光素酶的发光强度就可以定量地测定miRNA对应靶标的 mRNA调控的效果。另外构建miRNA的确定靶基因3 ‘UTR报告基因的载体还可以用于监测 miRNA表达水平，对miRNA表达调控进行评价。目前的验证靶基因的报告系统多为Ambion公司商业化的报告系统 pMIR-REPORT system,采用荧光报告的方法来验证靶基因，其内参照为pMIR-REPORT β-gal Control Plasmid0通过检测β-gal进行归一化。还有使用双荧光蛋白代替 luciferase。通过检测荧光强度和western-blotting检测EGFP表达来验证是否为目标 miRNA的靶基因。但是这些方法检测都较为繁琐。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供如下所述报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测 miRNA表达中的应用。本专利技术提供了如下所述报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。本专利技术的第二个目的是提供如下所述的试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测 miRNA表达中的应用。本专利技术提供了如下所述的试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。本专利技术的第三个目的是提供如下所述的载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测 miRNA表达中的应用。本专利技术提供了如下所述的载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种报告载体。本专利技术提供的报告载体，包括报告基因和分别位于所述报告基因上下游的启动子及多克隆位点；所述报告基因为萤火虫荧光素酶的编码基因。所述多克隆位点由以下酶的识别位点连接而成EcoRI，KpnI, SacI, NheI, SmaI, XhoLBglII ；所述启动子为启动目的基因转录的CMV启动子；所述萤火虫荧光素酶的氨基酸序列为序列表中序列6 ；所述萤火虫荧光素酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2。述报告载体为将含有多克隆位点的双链Linker区插入pCMV-luciferase载体的多克隆位点1得到的重组载体；所述pCMV-luciferase载体为将CMV启动子插入pGL3_Basic载体的多克隆位点 2得到的重组载体；所述含有多克隆位点的双链Linker区的核苷酸序列为序列表中序列1。所述多克隆位点1为^CbaI识别位点；所述多克隆位点2为KpnI和HindIII间的识别位点；所述pGL3-BasiC载体的多克隆位点2的下游为萤火虫荧光素酶的编码基因。本专利技术的第五个目的是提供一种用于鉴定miRNA靶基因的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括所述的报告载体和内参载体；所述内参载体为将所述的报告载体中的萤火虫荧光素酶的编码基因替换成海肾荧光素酶的编码基因得到的载体；所述海肾荧光素酶的氨基酸序列为序列表中的序列7 ；所述海肾荧光素酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3。本专利技术的第六个目的是提供一种用于鉴定miRNA靶基因的载体。本专利技术提供的载体，为将CFH的3' -UTR插入上述的报告载体的EcoRI和SmaI酶切位点得到的载体；所述CFH的3 ‘ -UTR的核苷酸序列为序列表中序列4。本专利技术的实验证明，本研究设计了 miRNA靶基因鉴定的双报告基因载体系统， 利用该系统检测到miRNA146a真核表达可以使报告基因活性下降，验证了文献的CFH是 miRNA 146a靶基因的结论，该系统还可以通过构建miRNA确定的靶标来监测细胞内miRNA内源表达水平，分析调控miRNA表达的因素。该系统的特点是在现有载体基础上进行改建而成的双报告系统，具有简单、便捷、实用和结果可信度高等特点，其成功构建和功能鉴定将能被应用于miRNA研究中的调控靶基因快速鉴定和对miRNA表达调控进行评价。附图说明图 1 为 pMIR-Luciferase 载体和 pMIR-control 载体构建结果 图2为pMIR-CFHUTR载体的构建图 3 为 pIRES2-EGFP_146a 的构建图 4 为 pIRES2-EGFP 和 pIRES2_EGFP_146a 表达检测图5为miR146a表达对CFH-UTR报告基因活性的影响具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、报告基因载体系统的构建克隆载体pMD18-T为TAKARA公司产品，载体pGL3_Basic，内参载体pRL_TK载体以及双报告基因检测试剂均为!Iomega公司的产品；大肠杆菌感受态DH5 α为北京博迈德生物科技公司生产；细胞系IfepG2(购自协和医科大学基础医学细胞中心)由本实验室保存提供；miRNA提取试剂盒为QIAGEN公司的miRNAeasy mini kit,反转录使用TAKARA公司的 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase Γ)，引物为上海生物工程有限公司合成。一、实验报告载体pMIR-Luciferase构建与鉴定l、pCMV_luciferase 载体的构建①设计CMV启动子引物见表1，以pcDNA3. 1+(购自hvitrogen公司编号 V790-20。)为模板，以CMV启动子上游引物和CMV启动子下游引物为引物进行PCR扩增，得到的600bp PCR产物，进行的琼脂糖电泳，结果如图IA所示，得到588bp的片段。回收PCR产物，与pMD18T载体(购自宝生物(大连)工程有限公司编号为DlOlA 连接，连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子；②提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将CMV启动子(Genbank编号 EF550208. 1序列中5，端第232-819位核苷酸。)插入pMD18T载体得到的质粒，将该质粒命名为 pMD18T-CMV。用KpnI和HindIII酶切pMD18T_CMV得到的小片段与经同样本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．如下权利要求４－８中所述报告载体在鉴定ｍｉＲＮＡ靶基因和／或检测ｍｉＲＮＡ表达中的应用。
【技术特征摘要】
1.如下权利要求4-8中所述报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。2.如下权利要求9所述的试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。3.如下权利要求10所述的载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。4.一种报告载体，包括报告基因和分别位于所述报告基因上下游的启动子及多克隆位点；所述报告基因为萤火虫荧光素酶的编码基因。5.根据权利要求4所述的报告载体，其特征在于所述多克隆位点由以下酶的识别位点连接而成EcoRI、Kpnl、SacI、NheI、SmaI、XhoI、BglII、HindIII ；所述启动子为启动目的基因转录的CMV启动子；所述萤火虫荧光素酶的氨基酸序列为序列表中序列6。6.根据权利要求4或5所述的报告载体，其特征在于所述萤火虫荧光素酶的编码基因核苷酸序列为序列表中序列2。7.根据权利要求4-6任一所述的报告载体，其特征在于所述报告载体为将含有多克隆位点的双链Linker区插入pCMV-luciferase载体的多克隆位点1得到的重组载体；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李军锋，周育森，鲍春旸，于虹，郭彦，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11
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