一种ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＴ１和ＧＳＴＰ１基因突变检测液相芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种ＧＳＴＰ１基因突变检测液相芯片，主要包括有：由５’端的ｔａｇ序列和３’端针对突变位点的特异性引物组成的ＡＳＰＥ引物，所述特异性引物是：针对Ａ３１３Ｇ突变位点的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１２、和针对Ｃ３４１Ｔ突变位点的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１４；所述ｔａｇ序列选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６；分别包被有特异的ａｎｔｉ－ｔａｇ序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明专利技术所制备的ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＴ１和ＧＳＴＰ１基因突变检测液相芯片具有非常好的信号－噪声比，并且所设计的探针以及ａｎｔｉ－ｔａｇ序列之间基本上不存在交叉反应，ｔａｇ标签序列、ａｎｔｉ－ｔａｇ标签序列的选取以及ｔａｇ标签序列与具体ＡＳＰＥ引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种 GSTMU GSTTl和GSTPl基因检测液相芯片。
技术介绍
谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S transferases, GSTs)是一个多功能的二相代谢酶家族，主要催化GSH(还原型谷胱甘肽)与亲电子化合物间的结合反应，使后者失去结合 机体DNA的活性，它是细胞抗损伤，抗癌变的主要解毒系统。另外，GSTs还可以和一 些配体如胆红素、留族化合物等结合，参与人体的生理反应。肿瘤细胞通过表达GSTs来 保护自身不受化疗药物的伤害，而基因突变可改变GSTs的活性，从而改变药物的药动力 学特征。近年来，GSTs与肿瘤和化疗、GSTs与其他严重疾病之间的关系已引起了研究 者的注意。按照染色体定位和序列同源性，迄今为止，已发现了 8种GSTs，研究较多的主 要有GSTM，GSTP, GSTT亚家族。其中，谷胱苷肽S转移酶Ml (GSTMl)定位于染 色体1P13.3，主要对多环芳烃类，乙烯环氧化物，苯乙烯等的中间产物进行代谢，存在 GSTMla、GSTMlb和null三个等位基因，null等位基因即整个基因的缺失，其个体在肝 脏中不能表达GSTM。GSTM的null基因型在不同种族人群中的频率范围变动很大，非 洲人为23% 48%，亚洲人为33% 63%，欧洲人为39% 62%，美国人群为23% 62%。此外，谷胱苷肽S转移酶Tl (GSTTl)基因缺失也是研究的热点。人谷胱甘肽 S-转移酶Pl (GSTPl)是细胞内降解生物异源物质的一组超家族同工酶GSTs中的一个重 要的亚型，能催化谷胱甘肽与亲电子物质发生反应，在肺脏中的含量尤其丰富，是肺脏 中重要的解毒酶，对芳香族化合物具有较高降解性，在预防肿瘤发生的过程中起重要作 用，但同时也是肿瘤细胞对化疗药物耐受的原因，研究表明，GSTPl基因的多态性位点 A313G和C341T与肿瘤的耐药性相关。目前对GSTM1、GSTTl和GSTPl多态性的检测产品一般是基于PCR技术的多重PCR、PCR-RFLP,实时荧光定量PCR和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污 染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种GSTPl基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检 测GSTPl基因两种常见基因型A313G和C341T的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种GSTPl突变检测液相芯片，主要包括有(A)针对GSTPl基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对 每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性 引物是针对A313G突变位点的SEQIDN0.11和SEQ ID N0.12、和针对C341T突变位点的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID N0.14 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag 序列选自SEQ ID N0.15 SEQ ID N0.20中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-teg序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出具有A313G和/或C341T的突变位点的GSTPl基因目标序列的 扩增引物。优选地，所述扩增引物为SEQIDN0.25及SEQIDN0J6、和SEQ ID N0.27及 SEQ ID N0.28o进一步地，本专利技术还提供了一种除GSTPl基因外，还包括GSTMl和/或GSTTl基因突变检测的液相芯片，其具体组成如下(A)还包括有针对GSTMl和/或GSTTl基因的缺失区域，分别设计的野生型 和突变型的ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的 特异性引物组成，所述特异性引物是针对GSTMl基因缺失区域的SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8、禾Π /或针对GSTTl基因缺失区域的SEQ ID Ν0.9或SEQ ID Ν0.10 ；相应的所 述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)还包括有分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所 述anti-tag序列选自SEQ ID NO.15 SEQ ID N0.20中的序列，所述anti-tag序列能相应 地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂 序列；(C)还包括有用于扩增出具有GSTMl和/或GSTTl的突变区域的目标序列的扩 增引物。优选地，所述扩增引物为针对GSTMl基因突变位点的SEQ ID N0.21和SEQ ID N0.22、禾Π /或针对GSTTl基因突变位点的SEQ ID Ν0.23和SEQ ID NOJ4。优选地，所述间隔臂序列为5-10个Τ。本专利技术的主要优点在于1.本专利技术所提供的液相芯片，其与测序法得到的检测结果吻合率高达100%。所 制备的GSTPl基因突变检测液相芯片，以及GSTM1、GSTTl和GSTPl基因突变检测液 相芯片都具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不 存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE弓丨 物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。2.本专利技术设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别 的基因型。3.本专利技术的所述液相芯片的检测方法步骤简单，四种基因多态性(包括两种缺 失型和两种单核苷酸突变型)检测可通过一步多重PCR即可完成的目标序列的扩增(如 果GSTM1、GSTTl为基因缺失纯合子，则没有扩增条带)，避免了反复多次PCR等复杂 操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定 性、定量分析特征。4.本专利技术不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺 陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提 高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。具体实施方式实施例1GSTMU GSTTl和GSTPl基因多态性检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对GSTMl和GSTTl基因缺失型、GSTPl基因的A313G突变(Ilel05Val， rsl695)和C341T突变(Alall4Val，rsll38272)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物 由“Tiig序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)基因基因型类型ASPE引物Tag序列特异性引物序列GSTMl缺失型wl5’ AATCAATCTTCATTCAAATCATCA (SEQ ID NO. 1)GAAACAAGGTAAAGGAGGAG 3' (SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＧＳＴＰ１基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：（Ａ）针对ＧＳＴＰ１基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ＡＳＰＥ引物对：每种ＡＳＰＥ引物由５’端的ｔａｇ序列和３’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对Ａ３１３Ｇ突变位点的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１２、和针对Ｃ３４１Ｔ突变位点的ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．１３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１４；所述ｔａｇ序列选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６；（Ｂ）分别包被有特异的ａｎｔｉ－ｔａｇ序列的、具有不同颜色编码的微球，所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列选自ＳＥＱＩＤ　ＮＯ．１５～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２０中的序列，所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列能相应地与（Ａ）中所选的ｔａｇ序列互补配对，且所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；（Ｃ）用于扩增具有Ａ３１３Ｇ和Ｃ３４１Ｔ的突变位点的ＧＳＴＰ１基因目标序列的扩增引物。

【技术特征摘要】
1.一种GSTPl基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对GSTPl基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每 种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性 引物是针对A313G突变位点的SEQIDNO.il和SEQ ID N0.12、和针对C341T突变位 点的 SEQ IDN0.13 和 SEQ ID N0.14 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQID NO. 15 SEQ ID N0.20中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所 选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有A313G和C341T的突变位点的GSTPl基因目标序列的扩增引物。2.根据权利要求1所述的GSTPl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物 为 SEQ IDN0.25 及 SEQ ID N0.26、禾口 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28。3.根据权利要求1所述的GSTPl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物 为针对GSTPl基因A313G突变位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 11组成的序列， 及由SEQ IDN0.4和SEQ ID NO. 12组成的序列；和针对GSTPl基因C341T突变位点的 由 SEQ ID N0.5 和 SEQ ID NO. 13 组成的序列，及由 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID NO. 14 组成 的序列。4.根据权利要求1所述的GSTPl基因突变检测液相芯片，其特征是，还包括有㈧ 针对GSTMl和/或GSTTl基因的缺失突变，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物 对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对缺失区域的特异性引物组成，所述 特异性引物是针对GSTMl基因缺失区域的SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8中的至少一 种、禾日/或针对GSTTl基因缺失区域的SEQ ID N0.9和SEQ ID NO. 10中的至少一种； 相应的所述tag序列选自SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)针对GSTMl和/或GSTTl基因的分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同 颜色编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，刘志明，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]