本发明专利技术涉及一种利用人体血清／血浆中稳定存在的１６种特定微小核糖核酸作为乳腺癌的检测标记物以及检测该标记物的方法、相关试剂盒及生物芯片。能够用于乳腺癌的诊断与鉴别诊断、疾病并发症的发生和复发的预测、疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价等方面，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于乳腺癌普查等相关工作，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高乳腺癌的临床检出率，成为早期诊断乳腺癌的有效手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及人血清/血浆中微小核糖核酸分子的分离、定性和定量分析，同时也涉及乳腺癌的各种临床指征。具体来说，本专利技术是一种利用乳腺癌病人 血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为乳腺癌的检测标记物以及检测该标记物 的方法、相关试剂盒及生物芯片，通过乳腺癌病人血清/血浆中微小核糖核酸的变化，在体 外诊断乳腺癌，判断乳腺癌发病过程，预测乳腺癌并发症的发生和乳腺癌复发的几率、以及 乳腺癌的预后，并分析药效和疗效。
技术介绍
乳腺癌已成全球女性发病率最高的恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女患乳腺 癌，50万人死于乳腺癌。仅约1-2%的乳腺患者是男性。中国在过去10年内的乳腺癌发病 率暴增47 %，每年有20余万乳腺癌新发病例。乳腺癌是治疗效果较好的恶性癌症之一，但前提是及早发现、及早治疗。目前乳腺 癌早期诊断(微小癌和TO期)在没有明显体表特征情况下诊出率不高。目前乳腺癌主要诊断方法包括乳腺钼靶摄像、CT、核磁共振和活组织病理检查。 同时辅助的检测手段还包括癌的免疫学反应、体内特殊化学成分的测定及酶反应等。血液 中如CAi5-3抗原，癌胚抗原(CEA)，泌乳素(PRL)等检测都可以对乳腺癌的诊断提供参考， 但这些检查假阳性与假阴性均较高，特异性不强。尽管越来越多的疾病标记物已经被发现并应用于临床疾病的普查、诊断和疗效的 监控，但是它们的临床应用效果还存在着明显不足。例如，肿瘤标记物、乳酸脱氢酶、癌胚抗 原等已被广泛应用于临床，但是这些疾病标记物还远远不能满足对癌症早期诊断的需要， 其主要原因有两个方面(1)上述疾病标记物的灵敏度和特异性相对较低，它们的检测结 果还不能作为疾病确诊的指标；(2)疾病的早期诊断率应与治疗的效果呈现正相关，而上 述任何一种疾病标记物还难以满足疾病早期诊断的这种要求。以癌症为例，由于存在着肿 瘤分化类别特异性过强、肿瘤整体敏感性较低、送检标本难以反复采取、标本保存要求条件 高等缺陷，同时价格昂贵，因此在现有条件下难以广泛推广应用现有的肿瘤标记物。而一 些传统医学手段，如组织细胞检测存在着其固有的缺陷，取材位置不当、组织细胞标本材料 不足或人为经验不足等都将导致误诊。其它技术例如影像学虽然已被广泛应用于疾病的检 查和诊断，但其在疾病程度的定性上仍存在着很大的局限性。因此目前非常有必要寻找能 够弥补现有标记物的上述缺陷的新型、灵敏并且应用方便的疾病检测标记物。微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链 小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发 育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着 紧密的联系。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核 糖核酸的表达水平均有不同程度的下调(Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM et al. Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients withdiffuse large B—cell lymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)；分析比较人月市 癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水 平相对于正常组织发生了变化(Garofalo M, Quintavalle C, Di Leva G et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene 2008)。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的 发生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联(Tryndyak VPiRoss SA，Belmd FA, Pogribny IP. Down-regulation of the microRNAs miR_34a，miR-127，and miR_200b in rat liver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet. Mol Carcinog. 2008 Oct 21)。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病发生 和发展之间存在着必然联系。由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它 与疾病存在以下的关联性首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制 因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表 达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通 路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是 因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的 剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变 化。因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性变化必 然与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通过抑制 疾病过程中上调的微小核糖核酸或过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓解疾病 的发生和发展。国内目前已有以微小核糖核酸作为疾病标记物的相关研究，如中国专利申请 CN100999765A和CN101298630A，它们均选取占恶性肿瘤发病率第4位的结肠癌作为研究对 象，经研究发现，在结肠良性息肉发展成恶性肿瘤期间，一些微小核糖核酸分子都存在着特 异性变化，并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化已经建立起一种更敏感、更精确的 早期确诊结肠癌的方法。然而由于组织标本的取材不容易使这种方法在临床上的广泛应用 受到了限制。
技术实现思路
为克服上述缺陷，本申请人将研究目光投向较易获得，甚至常规体检中就可以收 集到的血液。由于血液会循环至全身所有组织，并向细胞输送营养并清除废物，因此血液能 够反映出整个机体的生理病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。已知血清/血 浆中存在着多种蛋白，如总蛋白、白蛋白、球蛋白等，多种脂质，如HDL胆固醇、三甘油脂等， 多种糖质，色素，电解质和无机盐，多种酶，如淀粉酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、胆素脂酶、 醛缩酶等，同时还汇集了来自全身组织器官的多种信号分子，如细胞因子，激素等。目前，对 疾病的诊断仅仅局限于血清/血浆中的上述生化指标，尚无血清/血浆微小核糖核酸的报 道。人们传统观念中认为血清/血浆中没有核糖核酸分子，即使有也会很快被核糖核酸酶 降解为小分子片段而检测不到。但是，由于微小核糖核酸分子是19至23个核苷酸单元组成，具有结构上的特殊性和相对稳定性，它们极有可能存在于血清/血浆中。本申请专利技术 人之一张辰宇教授的前期研究已经证实，血清/血浆中稳定地存在微小核糖核酸，且每一 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乳腺癌检测标记物，其特征在于所述标记物包括以下在人体血清／血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意一种或一种以上： ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２５、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１０ａ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－３７８、ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－６２９或ｍｉＲ－１３０７。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：张辰宇，曾科，李海进，
申请(专利权)人：江苏命码生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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