注射用香菇多糖的分离纯化方法技术

本发明专利技术提供了注射用香菇多糖的分离纯化方法，采用水提醇沉法结合三氯醋酸法去蛋白得到香菇多糖粗品，香菇多糖粗品经过氧化氢脱色得脱色多糖，脱色多糖再经凝胶色谱法得注射用香菇多糖。本发明专利技术提供的注射用香菇多糖分离纯化方法工艺简单、产率高、显著降低制剂成本，有利于减轻患者经济负担，节约资源和保护环境，可用于注射用香菇多糖工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及天然药物化学，更具体涉及多糖分离纯化。
技术介绍
香菇多糖(lentinan)系伞燕科真菌香燕子实体中提取纯化的一种单一组分多糖(I)，是 --种免疫调节型抗肿瘤药物，它通过增强机体的抗肿瘤免疫防御反应而产生细胞介导的抗 肿瘤效果，发挥间接的抗肿瘤作用，对正常细胞不产生毒副作用，因此香菇多糖是国际公 认安全有效的抗肿瘤药物(参考专利技术专利ZL200410086152.4)。临床上香菇多糖主要用于胃 癌、肺癌、肠癌及癌性腹水等恶性肿瘤的治疗，另外香菇多糖对提高肝炎及艾滋病病人的 免疫功能均有较好作用。1985年香燕多糖最先在日本作为抗肿瘤药物进入临床，我国1988年开始进口日本味 之素的香菇多糖。目前国内市场上销售的主要是南京振中生物工程有限公司生产的注射用 香菇多糖(ZL专利号00112407.2)，其原料药生产工艺系参考文献Chihara.G., Maeda. Y.,, Hamuro.G et al. Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes(berk.) sing. Nature, 1965,222,687-688，生产过程中要用到十六烷基三甲基铵、氯仿、 正丁醇、醋酸等大量的有机试剂，工艺流程十分复杂，劳动强度大，环境污染大，而且香 菇多糖的得率非常低，仅为0.015%，成本相当高，lmg香菇多糖的价格达200元以上，极 大地限制了香燕多糖的临床应用。故寻找一种工艺简单、产率高、成本低廉的香菇多糖提 取纯化方法是更好地发挥香薛多糖制剂临床作用的首要任务，有利于减轻患者经济负担， 将给广大癌症患者带来福音，也有利于节约资源和保护环境，将大大地造福于人类。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供注射用香燕多糖的一种新的分离纯化方法，使其具有工艺简单、产 率高、成本低廉等特点。'实现本专利技术的技术方案是本专利技术提供的注射用香菇多糖分离纯化方法系采用水提醇沉 法结合三氯醋酸法去蛋白得到香燕多糖粗品，香菇多糖粗品经过氧化氢脱色得脱色多糖， 脱色多糖再经凝胶色谱法得注射用香菇多糖。本专利技术提供的包括以下步骤 a.取新鲜香菇或干香菇，经粉粹或不经粉粹；b.采用热水提取，浓縮； C.乙醇沉淀分离粗多糖；d. 三氯醋酸去蛋白；e. 乙醇沉淀；f. 过氧化氢脱色；g. 乙醇沉淀；h. 凝胶色谱法除杂质多糖和小分子；i. 冷冻干燥。上述步骤中所述的采用热水提取，浓縮的具体方法是加入相当于香菇干重8倍体积水， 沸水提取2次，浓缩至相当于香菇干重的2倍体积，得浓縮液；所述的乙醇沉淀分离粗多 糖的具体方法是向浓縮液中加入乙醇，使溶液乙醇浓度达50%以上，分离沉淀，得粗多 糖；所述的三氯醋酸去蛋白的具体方法是用水溶解粗多糖得粗多糖溶液，加入粗多糖溶 液体积1~2倍、浓度为5%三氯醋酸溶液，得去蛋白溶液；所述的向去蛋白溶液中加入乙醇， 使溶液乙醇浓度达50%以上，分离沉淀，得去蛋白多糖；所述的过氧化氢脱色的具体方法是去蛋白多糖以水溶解，滴加30%过氧化氢溶液，调终浓度为5~15%，过氧化氢脱色中水浴温度为40 60'C水浴,得脱色溶液；所述的过氧化氢脱色后的乙醇沉淀的具体方法是向脱 色溶液中加入乙醇，使溶液乙醇浓度达50%以上，分离沉淀，得脱色多糖；所述的凝胶色谱法除杂质多糖和小分子的具体方法是取脱色多糖，以交联葡聚糖凝胶Sephadex G-150 或S印hadexG-200为固定相，0.01~0.05M氯化钠或0.01~0.05M硫酸钠为流动相，进行 凝胶色谱分离，收集香菇多糖组分溶液；除杂质多糖和小分子；所述的冷冻干燥的具体方 法是将收集的香菇多糖组分溶液置冷冻千燥机内冻干，得白色粉末状注射用香菇多糖。本专利技术得到的注射用香菇多糖为白色粉末，含量为98 102%，重均分子量Mw为400 000 800 000Da(见图2)，得率为0.67% (以终产品与干香燕质量比计算)；傅立叶红外光 谱显示香菇多糖的特征吸收，主要特征为在3350~3300cm—'处为糖环上O-H的伸縮振动、 在2925-2915cm—'处为糖环上C-H的伸縮振动、在1100~1000cm—1处为糖环上C-0的伸 縮振动、在898 884cm—'处为p吡喃糖的C,-H弯曲振动，见图1。以上香菇多糖特征均符 合国家药品标准WS1-320 (X-263) -2004Z。注射用香菇多糖的含量测定方法为:精密量取香菇多糖对照品和供试品各25mg，分别 加0.5mol/L氢氧化钠溶液溶解配成25u g ml-1的对照品溶液和供试品溶液;精密量取对 照品溶液和供试品溶液2.5ml,分别沿管壁缓缓加至已精密加入硫酸蒽酮溶液5ml的试管中，使分层(以上操作均在冰浴中进行)，待剧烈振摇混匀后，立即置沸水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温。自振摇起，应在20 40分 钟内，以水为空白，照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV)在625nm的波长处 测定吸收度，计算即得。注射用香菇多糖的重均分子量测定方法为色谱条件PL aquagel MIXED凝胶色谱柱(300mmx7.5 mm);流动相为0.05M的NaCI 溶液，pH7.0;流速0.5mL/min;柱温30'C;进样量25jiL;标样为己知分子量DEXTRAN(分 子量1 000， 100 000， 40 000， 70 000， 500 000， 2 000 000 F，uka公司)；检测器为示差折 光检测器。测定方法将样品和已知分子量的标样葡聚糖，分别用流动相溶解制成每1mL中约含 10mg的溶液，分别注入25^L标准品溶液，记录示差色谱图，用WATERS GPC软件作标 准曲线，计算重均分子量及其分布。本专利技术提供的香菇多糖分离纯化方法与现有的香菇多糖生产工艺相比，具有产率高、污 染小、成本低的优点，适合于注射用香燕多糖的工业化生产(见表1)。表l香菇多糖的工艺比较工艺所用主要有机试剂产率 成本(每克香菇多糖)原工艺乙醇、醋酸、十六垸基三0.15% 8000元甲基溴化铵、三氯甲烷、正丁醇本工艺乙醇、三氯醋酸0.67% 40元附图说明图1为本专利技术得到的注射用香菇多糖的傅立叶红外光谱图； 图2为注射用香菇多糖的高效液相凝胶色谱洗脱图。具体实施方式 实施实例1称取1000g香恭子实体，剪碎,沸水煎煮1,过滤；药渣加水再煮沸1h，过滤；合并2次滤液， 浓縮；向浓縮液中缓缓加入无水乙醇/95%乙醇/75%乙醇使溶液乙醇浓度达50%以上，静置 过夜后抽滤，沉淀置低于60C干燥，得粗品；力口0.5M氢氧化钠使粗品溶解，向溶液中加入 1~2倍体积5%三氯醋酸，搅拌，放置过夜，抽滤；滤液调pH值至6 8，加入无水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇浓度达50%以上,放置过夜,抽滤，沉淀置低于60'C干燥，得香菇6粗多糖50g。取香菇粗多糖25.0g，加水溶解成深棕褐色溶液；4(TC水浴，滴加30%过氧化氢溶液， 调终浓度为5~15%，待溶液颜色变为淡黄色后停止水浴；向溶液中缓慢加入无水乙醇/95% 乙醇/75%乙醇使溶液乙醇浓度达50%以上，立即出现乳白色沉淀，静本文档来自技高网...

【技术保护点】
注射用香菇多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：　ａ．取新鲜香菇或干香菇，经粉粹或不经粉粹；　ｂ．采用热水提取，浓缩；　ｃ．乙醇沉淀分离粗多糖；　ｄ．三氯醋酸去蛋白；　ｅ．乙醇沉淀；　ｆ．过氧化氢 脱色；　ｇ．乙醇沉淀；　ｈ．凝胶色谱法除杂质多糖和小分子；　ｉ．冷冻干燥。

【技术特征摘要】
1.注射用香菇多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤a.取新鲜香菇或干香菇，经粉粹或不经粉粹；b.采用热水提取，浓缩；c.乙醇沉淀分离粗多糖；d.三氯醋酸去蛋白；e.乙醇沉淀；f.过氧化氢脱色；g.乙醇沉淀；h.凝胶色谱法除杂质多糖和小分子；i.冷冻干燥。2 .根据权利要求1所述的注射用香菇多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的采用 热水提取，浓縮的具体方法是加入相当于香菇干重8倍体积水，沸水提取2次，浓缩至 相当于香菇干重的2倍体积，得浓縮液。3.根据权利要求l所述的注射用香薛多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的乙醇 沉淀分离粗多糖的具体方法是向浓縮液中加入乙醇，使溶液乙醇浓度达50%以上，分离沉淀，得粗多糖。4 .根据权利要求1所述的注射用香菇多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的三氯醋酸去蛋白的具体方法是用水溶解粗多糖得粗多糖溶液，加入粗多糖溶液体积1~2倍、浓度为5%三氯醋酸溶液，得去蛋白溶液。5. 根据权利要求l所述的注射用香菇多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的向 去蛋白溶液中加入乙醇，使溶液乙醇浓度达50V...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯平，陈志祥，辜明，张玉，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：83[]