一种腺病毒载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了提供了一种重组腺病毒载体及其构建方法。该方法为将pRed/ET(Δα)电转到含有pAV.Des1d载体的DB3.1感受态中，用一个包含同源臂的Kan抗性片段进行同源重组，通过连续抗性压力下筛选出只具有Amp+Kan抗性，而没有Amp+Cm抗性的阳性克隆。第二步重组用带同源臂的attR4‑Cm‑ccdB‑attR2或attR4‑Cm‑ccdB‑attR3进行重组，再利用抗性筛选出只具有Amp+Cm抗性，而没有Amp+Kan抗性的正确的阳性克隆，从而得到本发明专利技术腺病毒载体。本发明专利技术腺病毒表达载体，且具有很好的准确性、高效性，成功率高。大大降低了人力时间成本，提高了用户体验。

【技术实现步骤摘要】
一种腺病毒载体及其构建方法
本专利技术属于生物
，涉及一种腺病毒载体及其制备方法。
技术介绍
腺病毒是一种无包膜的线性双链DNA病毒，广泛存在于大自然中，其基因组全长约36kb。腺病毒对大多数细胞有几乎100％的感染效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。由于腺病毒基因组不整合到宿主的基因组，所以腺病毒在宿主体内是瞬时表达。腺病毒可以直接感染动物个体，通常用于疫苗和基因治疗。由于以上种种优点，腺病毒载体是一种应用较为广泛的病毒载体系统，其中使用最广泛的是5型血清型腺病毒载体。为了提高腺病毒载体的生物安全性，人们对腺病毒基因组进行改造，构建出缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区的重组腺病毒载体。E1是腺病毒复制所必须的，E1的缺失使其不能自身复制，只能依靠包装细胞如293A细胞提供的反式互补进行复制扩增，而不能进行自主复制，E3基因表达的蛋白能对抗宿主的抗病毒防御系统，E3区的去除能减少宿主的体液免疫反应。Gateway技术是基于λ噬菌体位点专一重组系统的一种通用的克隆技术，能够快速地高特异性地将异源DNA片断克隆到不同的载体中。其特点是通过BP反应和LR反应最终把目的基因克隆到表达载体上。在Gateway技术中起到重组作用的是重组位点：attB,attP,attL和attR。在BPClonaseTMIIenzymemix催化的重组反应中，attB位点通常与attP位点发生重组。BP重组反应(BPrecombination)是指含有attP位点的供体载体(donorvector)与含有attB位点的PCR产物或者其它克隆之间的att位点序列交换反应。供体载体携带卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和一个ccdB自杀基因。氯霉素抗性基因和ccdB自杀基因位于两个attP位点之间。由于ccdB自杀基因只能存在于ccdBT1surviralcells、ccdBT2surviralcells或者DB3.1中，而对Top10、stbl3、DH5a这些细胞具有致死作用。若要复制供体载体，必须把供体载体转化到ccdBT1surviralcells、ccdBT2surviralcells或者DB3.1里才能随着宿主分裂而复制。BP重组反应的结果是attB-PCR产物中的目的序列交换到含有attP位点的供体载体内，而供体载体内的ccdB自杀基因和氯霉素抗性基因交换出去。BP重组反应产物被转化到非ccdBsurviralcells内，如Top10，再用含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。基于卡那霉素和自杀基因的双重筛选，90％的克隆都是正确的克隆。attB和attP位点重组后，序列发生交换，导致重组后的含有目的序列的供体载体上的attP位点序列产生了变化，attP位点变成成attL位点。一般将重组后的供体载体称为入门克隆(entryclone)。LR重组反应(LRrecombination)是指含有attL位点的入门克隆和含有attR位点的目的载体(destinationvector)之间的att位点序列交换反应。目的载体携带氨苄西林抗性基因、氯霉素抗性基因和ccdB基因。氯霉素抗性基因和ccdB自杀基因位于attR位点之间。由于ccdB自杀基因只能存在于ccdBT1surviralcells、ccdBT2surviralcells或者DB3.1中，而对Top10、stbl3、DH5a这些细胞具有致死作用。若要复制目的载体，必须把目的载体转化到ccdBT1surviralcells或者ccdBT2surviralcells里才能随着宿主分裂而复制。LR重组反应的结果是入门克隆attL位点间的目的序列交换到含有attR位点的目的载体内，而ccdB自杀基因和氯霉素抗性基因被交换出去。LR反应产物被转化到非ccdBsurviralcells内，如stbl3，再用含有氨苄西林的LB平板筛选阳性克隆。基于氨苄西林和自杀基因的双重筛选，90％的克隆都是正确的克隆。attL和attR位点重组后，序列发生交换，导致重组后的含有目的序列的目的载体上的attR位点序列产生了变化，重组成attB位点序列。一般将这样的目的载体称为表达克隆或者表达载体(expressionvector)。Gateway系统种类有以下三种：1)单片段重组系统(afragmentrecombinationsystem)在单片段重组系统中，一段末端含有attB1和attB2的PCR产物和含有attP1和attP2的供体载体pDONR221发生BP反应，产生含有目的序列的入门克隆pDown-xxx。这个入门克隆接着与含有attR1和attR2的目的载体发生LR反应，产生含有一段目的序列的表达载体。2)双片段重组系统(twofragmentsrecombinationsystem)在双片段重组系统(如图1)中，一段末端含有attB4和attB1r的PCR产物和含有attP4和attP1r的供体载体pDONRP4P1R发生BP反应，产生含有目的序列的入门克隆pUp-xxx。另一段末端含有attB1和attB2的PCR产物和含有attP1和attP2的供体载体pDONR221发生BP反应产生pDown-xxx。这两个入门克隆接着与含有attR4和attR2的目的载体发生LR反应，产生含有两段目的序列的表达载体。3)三片段重组系统在三片段重组系统中，一段末端含有attB4和attB1r的PCR产物和含有attP4和attP1r的供体载体pDONRP4P1r发生BP反应产生pUp-xxx，另一段末端含有attB1和attB2的PCR产物和含有attP1和attP2的供体载体pDONR221发生BP反应pDown-xxx，第三段末端含有attB2r和attB3的PCR产物和含有attP2r和attP3的供体载体pDONRP2rP3发生BP反应产生pTail-xxx。这三个入门克隆接着与含有attR4和attR3的目的载体发生LR反应，产生含有三段目的序列的表达载体。Red/ET同源重组技术是一种基于Rac噬菌体RecE/RecT或λ噬菌体Redα/Redβ/Redγ的大肠杆菌体内DNA同源重组系统，通过同源臂，在同源重组酶的作用下，可以将的目的片段同源重组到选定区域，从而产生研究者想要的特定位点缺失、插入、点突变等。pRed/ET是一种温度敏感型的同源重组酶表达载体，包含一个L-阿拉伯糖诱导的pBAD启动子，整个同源重组过程主要由三种蛋白来协同完成。其中来源于λ噬菌体的Redα蛋白具有5’-3’核酸外切酶活性；Redβ是一种退火蛋白，这两种蛋白协同作用催化整个同源重组；另外来源于λ噬菌体的Redγ蛋白会与大肠杆菌内源性的RecBCD核酸外切酶结合。重组腺病毒载体作为一种比较大(～36kb)的常规载体，利用常规的酶切连接方法在操作层面上显得很吃力，面临一个问题是大片段和小片段切开以后，大片段很难回收，市面上的胶回收试剂盒回收片段都是10kb以下，因此很难对骨架载体进行有效的回收。大部分文献涉及对腺病毒骨架的改造都是基于同源重组的方法，如其中一篇文献利用大肠杆菌BJ5183recBCsb本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将pRed/ET载体中的Redα基因删除，得pRed/ET(Δα)载体；2)将pRed/ET(Δα)载体转入含pAV.Des1d质粒的DB3.1感受态细胞，复苏培养；3)将复苏培养后的产物涂布到同时含有氨苄抗生素Amp、氯霉素Cm和四环素Tc的培养基平板上，避光培养，挑取阳性克隆菌A；4)将上步所得阳性克隆菌A加入含L‑阿拉伯糖的培养基中诱导表达同源重组酶并制备成感受态细胞，将带同源臂的Kan抗性表达盒PCR产物转入其中进行重组反应，复苏培养；5)将步骤4)的复苏培养产物涂布到含Amp、Kan和Tc的培养基平板上，避光培养，挑取重组阳性克隆菌B；6)将步骤5)中得到的阳性克隆菌B分别在液体培养基扩大培养，其中在含Amp、Kan和Tc的抗性培养基中生长，且在含Cm抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌C；7)将步骤6)中得到的目的阳性克隆菌C加入L‑阿拉伯糖诱导表达同源重组酶并制备成感受态细胞，将带同源臂的attR4‑Cm‑ccdB‑attR2或带同源臂的attR4‑Cm‑ccdB‑attR3片断转入其中进行重组反应；复苏培养；8)将步骤7)中复苏培养产物涂布到含Amp、Cm和Tc的培养基平板上，36.5～37.5℃培养，挑取重组阳性克隆菌D；9)将步骤8)中得到的阳性克隆菌D分别在液体培养基扩大培养，其中在含Amp和Cm的抗性培养基中生长，且在含Kan和Tc抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌E；该步骤中所有培养的培养温度为36.5～37.5℃；提取阳性克隆菌E中的质粒即得腺病毒载体。...

【技术特征摘要】
1.一种腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将pRed/ET载体中的Redα基因删除，得pRed/ET(Δα)载体；2)将pRed/ET(Δα)载体转入含pAV.Des1d质粒的DB3.1感受态细胞，复苏培养；3)将复苏培养后的产物涂布到同时含有氨苄抗生素Amp、氯霉素Cm和四环素Tc的培养基平板上，避光培养，挑取阳性克隆菌A；4)将上步所得阳性克隆菌A加入含L-阿拉伯糖的培养基中诱导表达同源重组酶并制备成感受态细胞，将带同源臂的Kan抗性表达盒PCR产物转入其中进行重组反应，复苏培养；5)将步骤4)的复苏培养产物涂布到含Amp、Kan和Tc的培养基平板上，避光培养，挑取重组阳性克隆菌B；6)将步骤5)中得到的阳性克隆菌B分别在液体培养基扩大培养，其中在含Amp、Kan和Tc的抗性培养基中生长，且在含Cm抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌C；7)将步骤6)中得到的目的阳性克隆菌C加入L-阿拉伯糖诱导表达同源重组酶并制备成感受态细胞，将带同源臂的attR4-Cm-ccdB-attR2或带同源臂的attR4-Cm-ccdB-attR3片断转入其中进行重组反应；复苏培养；8)将步骤7)中复苏培养产物涂布到含Amp、Cm和Tc的培养基平板上，36.5～37.5℃培养，挑取重组阳性克隆菌D；9)将步骤8)中得到的阳性克隆菌D分别在液体培养基扩大培养，其中在含Amp和Cm的抗性培养基中生长，且在含Kan和Tc抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌E；该步骤中所有培养的培养温度为36.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝田，罗燕，施金秀，王焕荣，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44