溶瘤腺病毒的构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种溶瘤腺病毒的构建方法和应用，包括以下步骤：步骤一：通过苏州泓迅生物科技股份有限公司全基因合成效应基因CRY的基因序列，得到CRY质粒；步骤二：溶瘤腺病毒载体基因经ExcoR I和Xba I双酶切后与CRY质粒构建成重组质粒；步骤三：将步骤二得到的重组质粒和辅助质粒共同转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。本发明专利技术可以用于制备小鼠乳腺肿瘤(但不仅限于乳腺肿瘤，还包括肺癌、肝癌等)疾病治疗药物，不仅能够直接杀死肿瘤细胞，而且能够通过治疗蛋白的作用诱导更多的细胞凋亡，从而有效抑制肿瘤的发生。

Construction and application of oncolytic adenovirus

The invention discloses a method for constructing oncolytic adenovirus and its application, which comprises the following steps: 1. CRY plasmid is obtained by sequencing the whole gene synthesis effect gene CRY of Suzhou Hongxun Biotechnology Co., Ltd; 2. The oncolytic adenovirus vector gene is digested by ExcoR I and Xba I, and the CRY plasmid is constructed. The recombinant plasmid was constructed; Step 3: The recombinant plasmid and auxiliary plasmid obtained in step 2 were co-transfected into the cells for virus packaging, and the target oncolytic adenovirus was obtained after the cells were diseased. The invention can be used for preparing disease treatment drugs for mouse breast tumors (but not only breast tumors, but also lung cancer, liver cancer, etc.). It can not only directly kill tumor cells, but also induce more apoptosis by the effect of therapeutic proteins, thereby effectively inhibiting the occurrence of tumors.

【技术实现步骤摘要】
溶瘤腺病毒的构建方法和应用
本专利技术属于生物
，特别是涉及一种溶瘤腺病毒的构建方法和应用。
技术介绍
溶瘤病毒(Oncolyticvirus)是优先感染并杀死肿瘤细胞的一类病毒。初期，部分肿瘤细胞被溶瘤病毒特异性感染和破坏。随后，溶瘤病毒在肿瘤细胞进行复制和增殖，释放出新的感染性病毒颗粒感染和破坏其他肿瘤细胞。溶瘤病毒通过直接溶解肿瘤细胞或者刺激宿主产生抗肿瘤免疫反应来发挥溶瘤的功效。溶瘤腺病毒，是目前最为常用的一种溶瘤病毒，有多种策略改造可以增强溶瘤腺病毒的肿瘤靶向性，包括将腺病毒基因组中参与细胞周期节点调控的功能基因(如E1A或E1B)进行突变或(和)利用肿瘤特异性启动子调控E1A基因的靶向转录调控，利用不同血清型腺病毒或RGD基序改变溶瘤腺病毒进入肿瘤细胞方式的靶向转导调控，以及利用细胞载体将溶瘤腺病毒传送至远处的肿瘤部位。溶瘤腺病毒作为一种载体，输送免疫调节基因或治疗性基因，通过增强抗肿瘤免疫，或引起肿瘤细胞凋亡、自杀等产生协同抗肿瘤效应。Cry基因又称为晶体蛋白质基因，是苏云金杆菌体内含有的一种基因。苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)，是一种包括许多变种的产晶体芽孢杆菌，可做微生物源低毒杀虫剂，以胃毒作用为主。该菌可产生两大类毒素，即内毒素(晶体蛋白)和外毒素，使害虫停止取食，最后害虫因饥饿和死亡，而外毒素作用缓慢，在蜕皮和变态时作用明显，这两个时期是RNA合成的高峰期，外毒素能抑制依赖于DNA的RNA聚合酶。苏云金杆菌的内毒素，在芽孢形成过程中产生于胞浆中，具有高度特异的杀虫活性。目前，建立在苏云金杆菌内毒素基础上的生物杀虫剂被广泛应用于农业昆虫害的防治。而且，将苏云金杆菌编码杀虫晶体蛋白的基因转入植物的基因组中获得抗虫的转基因烟草、马铃薯、西红柿、棉花以及玉米等植物也早已发展起来。然而，内毒素(晶体蛋白，Cry基因)对动物肿瘤细胞的杀伤作用的尚未有深入的研究。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种溶瘤腺病毒的构建方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：一种溶瘤腺病毒的构建方法和应用，包括以下步骤：步骤一：通过苏州泓迅生物科技股份有限公司全基因合成效应基因CRY的基因序列，得到CRY质粒；步骤二：溶瘤腺病毒载体经ExcoRI和XbaI双酶切后与CRY质粒构建成重组质粒；步骤三：将步骤二得到的重组质粒和辅助质粒共同转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。优选的是，所述溶瘤腺病毒载体的基因序列如SEQIDNO.1所示。优选的是，所述CRY的基因序列如SEQIDNO.2所示。优选的是，所述步骤三中选用对数生长期的HEK293细胞进行病毒包装。优选的是，所述步骤三中重组质粒的重量为5ug，辅助质粒的重量为5ug。优选的是，所述步骤三中的辅助质粒为pBHG质粒。优选的是，所述步骤三中使用Lipofectamine2000转染试剂进行转染。上述的溶瘤腺病毒在制备小鼠乳腺(但不仅限于乳腺肿瘤)肿瘤药物中的应用。本专利技术的有益效果至少具有以下几点：1、本专利技术将CRY基因导入溶瘤腺病毒载体中构成重组质粒，再转染至HEK293细胞中，包装成溶瘤腺病毒，并将该溶瘤腺病毒注射于小鼠的乳腺肿瘤细胞内，经鉴定该溶瘤腺病毒可以用于制备小鼠乳腺肿瘤(但不仅限于乳腺肿瘤，还包括肺癌、肝癌等)疾病治疗药物，不仅能够直接杀死肿瘤细胞，而且能够通过治疗蛋白的作用诱导更多的细胞凋亡，从而有效抑制肿瘤的发生；2、本专利技术将CRY基因构建至溶瘤腺病毒(包括但不仅限于溶瘤腺病毒的基因治疗载体)，用于肿瘤疾病治疗药物的开发；3、本专利技术将CRY基因利用肿瘤或者其他组织特异启动子，进行靶向启动的设计，使其用于肿瘤及相关疾病的药物开发；4、本专利技术将CRY基因通过蛋白质学的改造和优化用于肿瘤及相关疾病的药物开发；5、本专利技术将CRY基因表达成蛋白或者分段成多肽(或蛋白)，用于药物的研究及开发。附图说明图1是本专利技术重组质粒的PCR鉴定图；其中，1为重组质粒，2和3均为酶切后的重组质粒，M为DNAMarker(DNA分子量标准)；图2是本专利技术实验组和对照组两周内小鼠体内肿瘤的生长曲线图；图3是本专利技术实验组和对照组两周后小鼠体内肿瘤的重量对比图；图4是本专利技术实验组和对照组两周后小鼠肿瘤的尺寸对比图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例1：全基因合成效应基因CRY核苷酸序列通过苏州泓迅生物科技股份有限公司全基因合成效应基因CRY的基因序列，得到CRY质粒。实施例2：构建溶瘤腺病毒质粒(1)酶切体系：(2)琼脂糖凝胶电泳及胶回目的产物用1％Agrose，120V恒压电泳30～40min，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化。(3)将回收的载体产物和酶切胶回产物连接(室温1h)(4)连接产物转化1)取50ul感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司公司)放在冰上融化，取5ul连接产物和感受态细胞混匀；2)冰浴30min，42℃水浴热激90s，继续冰浴2min；3)在混合物中加入1ml无抗性SOB液体培养基，摇床37℃，250rpm/min，摇菌1h；4)摇菌结束后，4000rpm离心2min；5)除去部分上清后留约200ul混匀沉淀，涂于LB培养平板上，将板倒扣，37℃细菌培养箱中过夜(12～16h)，得重组质粒。实施例3：连接产物鉴定经质粒酶切鉴定，转染后的重组质粒与目的基因片段大小相符(结果如图1所示)，扩增产物为1017bp，该结果证明重组质粒构建成功。实施例4：溶瘤腺病毒包装1)转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞(由本公司提供)，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为达30％～40％，重新接种于细胞培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养，24h左右待细胞密度达到50％～60％时即可用于转染，细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数；2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清OMEM培养基；3)向一灭菌离心管中加入所制备的DNA溶液(重组质粒5ug和辅助质粒pBHG质粒5ug)与OMEM培养基混合均匀，调整总体积为50ul，在室温下温育5分钟；4)将Lipofectamine2000试剂(购置于赛默飞世尔科技(中国)有限公司)轻柔摇匀，取10ulLipofectamine2000试剂在另一离心管中与50ulOMEM混合，在室温下温育5分钟；5)把稀释后的DNA溶液与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；7)将DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物移至HEK293细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；8)培养6h～8h后倒去含有转染复合物的培养基，每瓶细胞加入2ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染复合物，然后倒去；9)每瓶细胞中加入含10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：通过苏州泓迅生物科技股份有限公司全基因合成效应基因CRY的基因序列，得到CRY质粒；步骤二：溶瘤腺病毒载体经ExcoR I和Xba I双酶切后与CRY质粒构建成重组质粒；步骤三：将步骤二得到的重组质粒和辅助质粒共同转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。

【技术特征摘要】
1.一种溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：通过苏州泓迅生物科技股份有限公司全基因合成效应基因CRY的基因序列，得到CRY质粒；步骤二：溶瘤腺病毒载体经ExcoRI和XbaI双酶切后与CRY质粒构建成重组质粒；步骤三：将步骤二得到的重组质粒和辅助质粒共同转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。2.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：所述溶瘤腺病毒载体的基因序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：所述CRY的基因序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘骏，周春艳，金丽，肖倩，谢伟建，刘清波，
申请(专利权)人：复百澳苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32