一种溶瘤腺病毒的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：步骤一：在NCBI数据库中调取Human mastadenovirus C全基因组序列信息和Tert‑p启动子序列，根据Tert‑p、E1A、E1B及的E1A和E1B之间的链接区域(FBLink)序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行化学合成至PUC57载体，得到PUC57‑Tert‑E1A‑FBLink‑E1B质粒；步骤二：设计引物对PUC57‑Tert‑E1A‑FBLink‑E1B质粒进行扩增；步骤三：腺病毒载体经SacII酶切；步骤四：同源重组法构建FV012‑Tert‑E1A‑FBLink‑E1B溶瘤腺病毒载体；步骤五：将步骤四得到的载体和腺病毒骨架质粒PBHG转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。本发明专利技术获得的溶瘤腺病毒的复制能力和杀肿瘤细胞的能力要强于TERT‑E1A‑IRES‑E1B结构的溶瘤腺病毒。

A construction method of oncolytic adenovirus

【技术实现步骤摘要】
一种溶瘤腺病毒的构建方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及一种溶瘤腺病毒的构建方法。
技术介绍
溶瘤病毒(Oncolyticvirus)，是指一类可以优先感染或者选择性杀伤肿瘤细胞的病毒，自然界中仅极少种类的病毒可以选择性的感染肿瘤细胞并对其杀伤，绝大多数病毒需要通过基因工程改造才能发挥溶瘤作用的。病毒具有消除肿瘤的疾病的新闻在20世纪初就被报道，起初研究者发现宫颈癌、伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤病人在感染某种病毒后肿瘤出现退化的现象。在20世纪中期，开始出现通过免疫接种或病毒感染来治疗癌症的方法，并取得了一定的效果。但是由于病毒改造技术有限、过强的免疫反应及并发症，导致临床应用几乎停滞不前。溶瘤腺病毒，是目前最为常用的一种溶瘤病毒，有多种策略改造可以增强溶瘤腺病毒的肿瘤靶向性，包括将腺病毒基因组中参与细胞周期节点调控的功能基因(如E1A或E1B)进行突变或(和)利用肿瘤特异性启动子调控E1A基因的靶向转录调控，利用不同血清型腺病毒或RGD基序改变溶瘤腺病毒进入肿瘤细胞方式的靶向转导调控，以及利用细胞载体将溶瘤腺病毒传送至远处的肿瘤部位。溶瘤腺病毒作为一种载体，输送免疫调节基因或治疗性基因，通过增强抗肿瘤免疫，或引起肿瘤细胞凋亡、自杀等产生协同抗肿瘤效应。那么，病毒在肿瘤细胞内的复制能力和对插入基因的表达量将会影响到溶瘤病毒的作用效果。目前，已经较为流行的溶瘤腺病毒OBP301，利用端粒酶启动子TERT启动腺病毒的E1A区通过IRES连接E1B区，形成Tert-E1A-IRES-E1B结构的溶瘤腺病毒，在小鼠体内获得了一定的溶瘤效果。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种溶瘤腺病毒的构建方法，通过TERT启动子启动5型腺病毒的E1区的基因组序列，使用5型腺病毒基因组上的一段序列将E1B基因和E1A基因连接，通过改造方法获得的溶瘤腺病毒的复制能力和杀肿瘤细胞的能力要强于TERT-E1A-IRES-E1B结构的溶瘤腺病毒，而对非肿瘤细胞的也是安全的。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：一种溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：步骤一：在NCBI数据库中调取HumanmastadenovirusC全基因组序列信息及Tert-p启动子序列信息，根据Tert-E1A-FBLink-E1B序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成至PUC57载体，得到PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B质粒；步骤二：设计引物对PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B质粒进行扩增；步骤三：腺病毒载体经SacII酶切；步骤四：同源重组法构建FV012-Tert-E1A-FBLink-E1B溶瘤腺病毒载体；步骤五：将步骤四得到的载体和腺病毒骨架质粒pBHG转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。本专利技术为解决其技术问题所采用的进一步技术方案是：进一步地说，所述Tert的基因序列如SEQIDNO.1所示。进一步地说，所述E1A的基因序列如SEQIDNO.2所示。进一步地说，所述FBLink的基因序列如SEQIDNO.3所示。进一步地说，所述E1B的基因序列如SEQIDNO.4所示。进一步地说，所述腺病毒载体为腺病毒载体FV012。本专利技术的有益效果具有以下几点：1、本专利技术所构建的Tert-E1A-FBLink-E1B的对肿瘤(以肝癌细胞Hep3B为例)的杀伤效果要优于Tert-E1A-IRES-E1B结构的溶瘤腺病毒；2、本专利技术所构建的Tert-E1A-FBLink-E1B对正常细胞无明显的杀伤作用，即该病毒也是相对安全的；3、本专利技术所构建的Tert-E1A-FBlink-E1B的对肿瘤细胞的活性抑制效果要优于Tert-E1A-IRES-E1B结构的溶瘤腺病毒。附图说明图1是本专利技术细胞出毒图片(CPE100x明场)；图2是本专利技术细胞出毒图片(CPE100x绿色荧光)；图3是本专利技术所构建的Tert-E1A-FBlink-E1B与Tert-E1A-IRES-E1B对肿瘤细胞的杀伤实验结果图；图4是本专利技术所构建的Tert-E1A-FBlink-E1B与Tert-E1A-IRES-E1B对细胞的活性抑制结果图(FV154为溶瘤腺病毒)；图5是本专利技术小鼠肿瘤内注射溶瘤腺病毒实验结果图；图6是本专利技术两个试验组和一个对照组中小鼠肿瘤体积变化曲线图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例1：PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B质粒扩增1)在NCBI数据库中调取HumanmastadenovirusC全基因组序列信息及Tert-p启动子序列信息；2)根据Tert-E1A-FBLink-E1B序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成至PUC57载体，并命名为：PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B；3)PCR引物信息PrimerF:5’-TTTGTCTAGGGCCGCGGGGACTTTGACCGTTTACGTGGAGACTtggcccctccctcggg-3’PrimerR:5’-AGAAAAACACCTGGGCGtcaatctgtatcttcatcgctagagccaaac-3’注：PrimerF和PrimerR未划线部分是腺病毒载体FV012同源序列，划线处是Tert-E1A-FBLink-E1B特异性引物序列。4)PCR体系配制5)PCR反应条件6)琼脂糖凝胶电泳及胶回目的产物a)1％琼脂糖凝胶，220V电压条件下电泳30min；b)电泳结束后将胶块放置在切胶台上，切下目的片段放入已灭菌1.5mlEP管中；c)按照TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收操作；d)将回收的DNA测定其浓度及260/280值，储存于-20℃备用。实施例2：腺病毒载体FV012酶切名称加入量腺病毒载体FV0121ngSacII(NEB)1μL10XBuffer2μLTotalddH2O补齐至20ul酶切反应条件37℃/30min，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳。实施例3：琼脂糖凝胶电泳及胶回目的产物1)1％琼脂糖凝胶，220V电压条件下电泳30min；2)电泳结束后将胶块放置在切胶台上，切下目的片段放入已灭菌1.5mlEP管中；3)按照TI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一：在NCBI数据库中调取Human mastadenovirus C全基因组序列信息及Tert-p启动子序列信息，根据Tert-E1A-FBLink-E1B序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成至PUC57载体，得到PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B质粒；/n步骤二：设计引物对PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B质粒进行扩增；/n步骤三：腺病毒载体经SacII酶切；/n步骤四：同源重组法构建FV012-Tert-E1A-FBLink-E1B溶瘤腺病毒载体；/n步骤五：将步骤四得到的载体和腺病毒骨架质粒pBHG转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：在NCBI数据库中调取HumanmastadenovirusC全基因组序列信息及Tert-p启动子序列信息，根据Tert-E1A-FBLink-E1B序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成至PUC57载体，得到PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B质粒；
步骤二：设计引物对PUC57-Tert-E1A-FBLink-E1B质粒进行扩增；
步骤三：腺病毒载体经SacII酶切；
步骤四：同源重组法构建FV012-Tert-E1A-FBLink-E1B溶瘤腺病毒载体；
步骤五：将步骤四得到的载体和腺病毒骨架质粒pBHG转染到细胞中进行病毒包装，待细...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘骏，徐金凤，金丽，周春艳，谢伟建，
申请(专利权)人：复百澳苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32