蓝光诱导激活的Cre重组优化系统及其应用技术方案

本申请公开了一种蓝光诱导激活的Cre重组优化系统及应用。所述系统产生的Cre重组酶主要由两个相互分离的融合蛋白CIB1‑CreC

Blue light induced activation of CRE recombination optimization system and its application

【技术实现步骤摘要】
蓝光诱导激活的Cre重组优化系统及其应用
本专利技术涉及生物
，具体说是一种蓝光诱导激活的Cre重组优化系统及其应用。
技术介绍
Cre重组酶来源于P1噬菌体，属于酪氨酸重组酶家族。它可以特异性的识别一段长度为34bp的DNA序列(loxp)，使loxp位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶不仅效率高，还具有高度序列识别特异性，因此科学家们构建了许多Cre重组酶转基因小鼠模型，它们在研究基因功能和机体发育方面具有不可比拟的重要作用。据文献报道，如果Cre重组酶在体内一直表达会影响小鼠心肺等组织的发育，所以有效的控制重组酶的表达就显得尤为重要。目前已经报道的可诱导Cre重组酶转基因小鼠模型包括Cre-ERT2和DD-Cre。二者都是用化学药物诱导，具有一定的局限性，表现为诱导时间较长，作用范围大，可能会扰乱细胞内源信号通路。虽然可以借助特异性的启动子在一定程度上实现空间特异性，但对于全身分布缺乏组织特异性的细胞群体无法实现精确操控。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种蓝光诱导激活的Cre重组优化系统及其应用。本专利技术对蓝光诱导激活的Cre重组酶系统PA-Cre进行了优化改造，提高了Cre重组酶活性的同时极大的降低了系统的泄露。将其转入细胞系或动物中获得的转基因细胞系或转基因动物，不仅可以通过控制光照的时间和空间来实现更为精确的时空特异性调控，还为后续研究提供了更为合适的工具。一方面，本专利技术提供一种蓝光诱导激活的Cre重组优化系统，所述系统含有蓝光诱导激活的Cre重组酶表达盒，所述表达盒包括按如下顺序连接的基因：光敏蛋白配体CIB1的编码基因、Cre重组酶C端的编码基因、光敏蛋白CRY2的编码基因、Cre重组酶N端的编码基因；所述Cre重组酶C端包括SEQIDNo.1所示氨基酸序列(Cre重组酶N端第106-343位)；所述Cre重组酶N端包括SEQIDNo.3所示氨基酸序列(Cre重组酶N端第19-104位)；优选的，所述Cre重组酶C端的编码基因序列如SEQIDNo.2所示；所述Cre重组酶N端的编码基因序列如SEQIDNo.4所示。为了便于Cre重组酶的表达以及研究细胞或动物中基因的功能等，所述系统中还含有Cre重组酶所识别的两个相互间隔的loxP，所述两个相互间隔的loxP位于不同于所述表达盒的载体上或已整合在细胞或动物基因组上。在一种优选的实施方式中，所述表达盒中还包括第一连接肽的编码基因和第二连接肽的编码基因，所述第一连接肽的编码基因位于所述光敏蛋白配体CIB1的编码基因和所述Cre重组酶C端的编码基因之间，所述第二连接肽的编码基因位于所述光敏蛋白CRY2的编码基因和所述Cre重组酶N端的编码基因之间，优选的，所述第一连接肽和所述第二连接肽包括SEQIDNo.5、6、7、或8所示氨基酸序列，更优选，SEQIDNo.5；更优选的，所述第一连接肽和所述第二连接肽的编码基因包括SEQIDNo.9所示核苷酸序列。在一种优选的实施方式中，所述表达盒中还包括核定位信号NLS的编码基因，优选的，所述核定位信号NLS的编码基因位于所述光敏蛋白CRY2的编码基因前或所述光敏蛋白配体CIB1的编码基因前，更优选，所述光敏蛋白配体CIB1的编码基因前，优选的，所述核定位信号NLS包括SEQIDNo.10所示氨基酸序列，更优选的，所述核定位信号NLS的编码基因包括SEQIDNo.11所示核苷酸序列。在一种优选的实施方式中，所述表达盒中还包括启动子，所述启动子为CAG或CMV，优选CAG；更优选的，所述CAG的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。在一种优选的实施方式中，所述表达盒中还包括自剪切蛋白的编码基因或IRES(内部核糖体进入位点序列)，所述自剪切蛋白的编码基因或IRES位于所述Cre重组酶C端的编码基因与所述光敏蛋白CRY2的编码基因之间，优选的，所述IRES的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，所述自剪切蛋白为P2A、T2A、或F2A，更优选，T2A，更优选的，所述T2A的氨基酸序列如SEQIDNo.14所示，更优选的，所述T2A的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。在一种优选的实施方式中，所述表达盒中还包括转录调控元件，所述转录调控元件位于所述Cre重组酶N端的编码基因之后，所述转录调控元件包括WPRE元件，所述WPRE元件为土拨鼠肝炎病毒转录后调控元(WoodchuckHepatitisViruspost-transcriptionalregulatoryelement,WPRE)，在转录及转录后调控阶段具有重要作用，能够在一定程度上提高蛋白的表达水平；优选的，所述WPRE元件包括SEQIDNo.16所示核苷酸序列；和/或，所述表达盒中还包括蛋白标签序列的编码基因，优选的，所述蛋白标签序列的编码基因位于所述启动子与所述核定位信号NLS的编码基因之间，所述蛋白标签包括MyC、His、GST、HA、Flag、MBP、AviTag、SUMO、c-Myctag中的任一种或至少两种；优选，Flag，更优选3×Flag。在一种优选的实施方式中，所述光敏蛋白配体CIB1包括SEQIDNo.17所示的氨基酸序列，优选的，所述光敏蛋白配体CIB1的编码基因序列包括SEQIDNo.18所示的核苷酸序列。在一种优选的实施方式中，所述光敏蛋白CRY2包括SEQIDNo.19所示的氨基酸序列，优选的，所述光敏蛋白CRY2的编码基因序列包括SEQIDNo.20所示的核苷酸序列。另一方面，本专利技术提供了含有以上任一所述表达盒的重组载体，所述重组载体为质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体、EB病毒载体、或单纯疱疹病毒载体；优选的，所述质粒载体为Cre/loxP重组酶系统质粒，或睡美人转座子系统质粒。另一方面，本专利技术保护以上任一所述表达盒或重组载体在制备蓝光诱导激活的Cre重组酶转基因细胞系或转基因动物模型中的应用，所述动物为哺乳动物，优选为小鼠或大鼠，更优选为小鼠。在上述应用中，所述蓝光诱导激活的Cre重组酶转基因细胞系中，所述蓝光的强度为3-5mw/cm2，照射方式为蓝光照射20-40s开、2-5min关；所述蓝光诱导激活的Cre重组酶转基因动物中，所述蓝光的强度为15-25mw/cm2，照射方式为0.5-2min开、3-5min关。另一方面，本专利技术保护由以上任一所述Cre重组优化系统或重组载体制备得到的蓝光诱导激活的Cre重组酶转基因细胞系或转基因动物在基因功能研究、谱系示踪、细胞清除中的应用。本专利技术的有益效果如下：1.首次建立光控Cre重组酶转基因小鼠模型。现有的光控Cre重组酶系统均是在细胞上做各种研究，但细胞水平并不能充分模拟动物水平本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蓝光诱导激活的Cre重组优化系统，其特征在于：所述系统含有蓝光诱导激活的Cre重组酶表达盒，所述表达盒包括按如下顺序连接的基因：光敏蛋白配体CIB1的编码基因、Cre重组酶C端的编码基因、光敏蛋白CRY2的编码基因、Cre重组酶N端的编码基因；/n所述Cre重组酶C端包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列；所述Cre重组酶N端包括SEQ IDNo.3所示氨基酸序列；/n优选的，所述Cre重组酶C端的编码基因序列如SEQ ID No.2所示；所述Cre重组酶N端的编码基因序列如SEQ ID No.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种蓝光诱导激活的Cre重组优化系统，其特征在于：所述系统含有蓝光诱导激活的Cre重组酶表达盒，所述表达盒包括按如下顺序连接的基因：光敏蛋白配体CIB1的编码基因、Cre重组酶C端的编码基因、光敏蛋白CRY2的编码基因、Cre重组酶N端的编码基因；
所述Cre重组酶C端包括SEQIDNo.1所示氨基酸序列；所述Cre重组酶N端包括SEQIDNo.3所示氨基酸序列；
优选的，所述Cre重组酶C端的编码基因序列如SEQIDNo.2所示；所述Cre重组酶N端的编码基因序列如SEQIDNo.4所示。


2.根据权利要求1所述的Cre重组优化系统，其特征在于：所述表达盒中还包括第一连接肽的编码基因和第二连接肽的编码基因，
所述第一连接肽的编码基因位于所述光敏蛋白配体CIB1的编码基因和所述Cre重组酶C端的编码基因之间，
所述第二连接肽的编码基因位于所述光敏蛋白CRY2的编码基因和所述Cre重组酶N端的编码基因之间，
优选的，所述第一连接肽和所述第二连接肽包括SEQIDNo.5、6、7、或8所示氨基酸序列，更优选，SEQIDNo.5；
更优选的，所述第一连接肽和所述第二连接肽的编码基因包括SEQIDNo.9所示核苷酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的Cre重组优化系统，其特征在于：所述表达盒中还包括核定位信号NLS的编码基因，
优选的，所述核定位信号NLS的编码基因位于所述光敏蛋白CRY2的编码基因前或所述光敏蛋白配体CIB1的编码基因前，更优选，所述光敏蛋白配体CIB1的编码基因前，
优选的，所述核定位信号NLS包括SEQIDNo.10所示氨基酸序列，更优选的，所述核定位信号NLS的编码基因包括SEQIDNo.11所示核苷酸序列。


4.根据权利要求1—3中任一所述的Cre重组优化系统，其特征在于：所述表达盒中还包括启动子，所述启动子为CAG或CMV，优选CAG；
更优选的，所述CAG的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。


5.根据权利要求1—4中任一所述的Cre重组优化系统，其特征在于：所述表达盒中还包括自剪切蛋白的编码基因或IRES，
所述自剪切蛋白的编码基因或IRES位于所述Cre重组酶C端的编码基因与所述光敏蛋白CRY2的编码基因之间，
优选的，所述IRES的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，
所述自剪切蛋白为P2A、T2A、或F2A，更优选，T2A，
更优...

【专利技术属性】
技术研发人员：李大力，李慧莹，吴英尹，刘明耀，
申请(专利权)人：华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31