一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法技术

本发明专利技术提供一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，其特征在于通过构建了同时表达目的基因和转座酶SB100X的载体系统，在简化实验操作的同时，在真核细胞中提高了转座子介导的稳定转染效率。更具体的，本发明专利技术通过构建了单载体SB‑2in1‑DEST，用GFP为目的基因来测试，使稳定转染GPF的细胞比例比转座子双载体系统提高了约2.5倍，证明本发明专利技术的转染方法能显著提高非病毒稳定转染的效率。而且，本发明专利技术构建的SB‑2in1‑DEST载体，可以采用Gateway系统方便地将目的基因克隆进去，简化了克隆所需的技术和时间。

A stable transfection method of non viral eukaryotic cells mediated by transposon

【技术实现步骤摘要】
一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法
本专利技术属于基因
，具体涉及一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法。
技术介绍
真核细胞的稳定转染有病毒和非病毒两种，病毒为载体的方法虽然效率高，但携带的基因大小受到限制，而且因为病毒有潜在的致癌性，是显著的安全隐患。非病毒载体的优点是安全性好，但缺点是效率低。理想的真核细胞转染技术要同时具有求安全性和高效性，但目前的方法都有不足，这是目前真核细胞，特别是原代真核细胞基因修饰的技术瓶颈。转座子（Transposon）是一类DNA片段，能够在转座酶的作用下，插入基因组DNA的其他部位，故也称“跳跃基因”。通过对鲑鱼科一种特殊转座子SB的分析，Ivics等发现该转座子本身携带一个失活的SB转座酶基因，导致该转座子中的DNA片段不能转移到其他部位。通过随机突变，Ivics等重建出具有活性的SB转座酶，该转座酶能使SB转座子被激活，转座子活性被唤醒，故称为睡美人系统（sleepingbeauty,SB）。SB转座酶通过识别转座子两端的反向末端重复序列（Invertedterminalrepeats,ITR），介导SB转座子被切除下来，插入基因组新位置，故类似于“剪切—粘帖”。目前SB系统已成为基因组学研究的强大工具，利用了SB系统介导的DNA整合来获得稳定表达目的基因的细胞，目前效果最强的SB转座酶是SB100X。而且，除了安全性好，SB系统的另一个特点是可以加载大的基因片段，这也优于病毒载体。如图1所示，以往的SB系统包括两个质粒，一个是编码SB转座酶的质粒，另一个是携带目的基因的质粒，该目的基因两侧有ITR，联合转染两个质粒后，目的基因能高效插入到基因组中，形成整合性的稳定转染，该方法安全可靠。但是双载体SB系统的稳定转染效率低，基因克隆所需技术和时间要求高。如图1所示，SB系统工作原理：目前的SB系统包括两个载体，一个编码SB转座酶（载体1），一个含目的基因和两端的ITR（载体2），共转染细胞后，SB转座酶表达，介导目的基因从载体2上剪切下来，并在SB转座酶的作用下，以整合的方式插入基因组新位置，结果目的基因能稳定表达。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法。本专利技术将最强的SB100X转座酶编码基因和目的基因整合到一个载体上，形成了SB单载体系统，显著提高非病毒稳定转染的效率，另外，采用Gateway系统能方便地将目的基因克隆进去，简化了制备表达载体所需的技术和时间。本专利技术的实施例提供一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，包括如下步骤：（1）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，合成EF1启动子驱动的SB100X表达载体，即EF1-SB100X载体，测序鉴定序列的准确性；（2）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，构建CMV启动子驱动的，两端具有ITR序列的目的基因，即ITR-CMV-GFP载体，测序鉴定序列的准确性；（3）利用PCR技术，借助pbluesript载体的多克隆位点，构建SB-2in1-DEST克隆载体，该载体包含了ITR、EF1-SB100X序列和用于Gateway克隆的序列；（4）利用Gateway技术，将表达目的基因GFP的Entry克隆和SB-2in1-DEST重组，构建出SB-2in1-GFP载体，测序鉴定序列的准确性。该载体包含了GFP和SB100X的表达序列，转染后可以使SB100X瞬时表达，介导GFP基因整合到基因组DNA，最终达到稳定表达的效果；（5）取0.1ng的EF1-SB100X、ITR-CMV-GFP或SB-2in1-GFP载体，按照产品说明书转化DH5α感受态菌种；（6）挑取单个的菌克隆，在3-5ml的含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，提取质粒，再次测序验证序列的准确性；（7）验证后的克隆在100ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，采用PureLinkHiPurePlasmidMidiprepKit试剂盒（Invitorgen公司）提取转染级的质粒，测量DNA浓度和纯度；（8）采用Lonza的ElectroporationandNucleofector在所选择的真核细胞中同时转染两个质粒或SB-2in1-GFP质粒；（9）转染细胞扩增10天，然后利用流式细胞仪鉴定各组稳定转染的细胞比例。其中，步骤（2）和步骤（4）中所用目的基因为GFP基因。其中，步骤（4）中用Gateway克隆酶ClonaseII将目的基因从Entry克隆里直接转移到SB-2in1-DEST中，完成SB-2in1-GFP载体的构建。其中，步骤（5）中，转化产物分别接种到含100ug/ml氨苄青霉素的琼脂糖平板上，培养16小时。进一步，接种环取5ul的菌液。其中，步骤（6）中，1ml菌液用含20%甘油的LB培养基冻存在-80℃。其中，步骤（7）于无菌环境下操作。本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：本专利技术通过构建了单载体SB-2in1-GFP，使稳定转染GPF的细胞比例比双载体系统提高了约2.5倍，证明本专利技术的转染方法能显著提高非病毒稳定转染的效率。而且，本专利技术构建了SB-2in1-DEST载体，可以采用Gateway系统方便地将目的基因克隆进去，简化了克隆所需的技术和时间。附图说明图1为本专利技术
技术介绍
中现有的SB系统的示意图；图2为本专利技术中构建的EF1-SB100X载体结构图；图3为本专利技术中构建的ITR-CMV-GFP载体结构图；图4为本专利技术中构建的SB-2in1-DEST载体结构图；图5为本专利技术中构建的SB-2in1-GFP载体结构图；图6为本专利技术的中HBEC细胞转染2天和10天后流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例示意图；图7位本专利技术中的PC-9细胞转染2天和10天后流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例示意图。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。本专利技术提供了一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，包括如下步骤：（1）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的SB100X基因的DNA序列（参考https://www.addgene.org/34879/），以pbluesript载体为模版，合成EF1启动子驱动的SB100X表达载体，即EF1-SB100X载体（图2），测序鉴定序列的准确性。EF1-SB100X载体是用来测试双载体系统的转染效率。如图2所示，EF1-SB100X载体结构图：该载体是在pbluecript载体的框架上构建。主要包括真核启动子EF1α和SB100X基因的表达序列。下游的BGHpoly本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，其特征在于安全和高效，包括如下步骤：/n（1）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，合成EF1启动子驱动的SB100X表达载体，即EF1-SB100X载体，测序鉴定序列的准确性；/n（2）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，构建两端具有末端重复序列ITR的目的基因，即ITR-CMV-GFP载体，测序鉴定序列的准确性；/n（3）利用PCR技术，借助pbluesript载体的多克隆位点，构建SB-2in1-DEST载体，测序鉴定序列的准确性；/n（4）利用Gateway技术，将表达目的基因的Entry克隆和SB-2in1-DEST重组，构建出SB-2in1-GFP载体，该载体包含了ITR-CMV-GFP和EF1-SB100X序列，测序鉴定序列的准确性；/n（5）转化EF1-SB100X、ITR-CMV-GFP或SB-2in1-GFP载体到DH5α感受态菌种；/n（6）挑取单个的菌克隆，在3-5ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，提取质粒，再次测序验证序列的准确性；/n（7）验证后的克隆在100ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，采用PureLinkHiPure Plasmid Midiprep Kit试剂盒提取转染级的质粒，测量DNA浓度和纯度；/n（8）采用Lonza的Electroporation and Nucleofector在所选择的真核细胞中同时转染两个质粒或SB-2in1-GFP质粒；/n（9）转染后细胞扩增10天，然后利用流式细胞仪鉴定各组稳定转染的细胞比例。/n...

【技术特征摘要】
1.一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，其特征在于安全和高效，包括如下步骤：
（1）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，合成EF1启动子驱动的SB100X表达载体，即EF1-SB100X载体，测序鉴定序列的准确性；
（2）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，构建两端具有末端重复序列ITR的目的基因，即ITR-CMV-GFP载体，测序鉴定序列的准确性；
（3）利用PCR技术，借助pbluesript载体的多克隆位点，构建SB-2in1-DEST载体，测序鉴定序列的准确性；
（4）利用Gateway技术，将表达目的基因的Entry克隆和SB-2in1-DEST重组，构建出SB-2in1-GFP载体，该载体包含了ITR-CMV-GFP和EF1-SB100X序列，测序鉴定序列的准确性；
（5）转化EF1-SB100X、ITR-CMV-GFP或SB-2in1-GFP载体到DH5α感受态菌种；
（6）挑取单个的菌克隆，在3-5ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，提取质粒，再次测序验证序列的准确性；
（7）验证后的克隆在100ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，采用PureLinkHiPurePlasmidMidiprepKit试剂盒提取转染级的质粒，测量DNA浓度和纯度；
（8）采用Lonza的ElectroporationandNucleofector在所选择的真核...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓荣，丁晓凌，汪晓莺，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32