封闭CD47并激发抗肿瘤免疫的重组溶瘤腺病毒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及封闭CD47并激发抗肿瘤免疫的重组溶瘤腺病毒及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：SIRPα‑Fc基因，即SIRPαCV1结合区与人IgG1 Fc段基因的融合基因或其简并序列；或SIRPα‑Fc基因通过连接序列与其他外源基因连接形成的多核苷酸序列或其简并序列。本发明专利技术的重组溶瘤腺病毒可在肿瘤细胞内高效表达外源基因SIRPα‑Fc，SIRPα‑Fc能与肿瘤细胞表面CD47特异性结合，阻断CD47‑SIRPα的负调节作用，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，并能同时引发ADCC效应和CDC效应，激发机体抗肿瘤免疫，增强抗肿瘤效能。

Recombinant oncolytic adenovirus blocking CD47 and stimulating anti-tumor immunity and its uses

The invention relates to a recombinant oncolytic adenovirus that blocks CD47 and stimulates anti-tumor immunity and uses thereof. In particular, the present invention provides a recombinant adenovirus vector which can be operated to insert or contain the following foreign genes: the SIRP alpha Fc gene, the fusion gene of the SIRP alpha CV1 binding region and the human IgG1 Fc segment gene or its degenerate sequence, or the SIRP alpha Fc gene linked to other exogenous genes through the connection sequence. Nucleotide sequence or its degenerate sequence. The recombinant oncolytic adenovirus can efficiently express the exogenous gene SIRP alpha Fc in the tumor cells, and SIRP alpha Fc can bind to the CD47 specific surface of the tumor cells, block the negative regulation of CD47 SIRP alpha, enhance the phagocytosis of the macrophage to tumor cells, and can simultaneously induce ADCC effect and CDC effect to stimulate the body's resistance. The tumor is immunized to enhance the antitumor effect.

【技术实现步骤摘要】
封闭CD47并激发抗肿瘤免疫的重组溶瘤腺病毒及其用途
本专利技术属于基因工程学和肿瘤学，涉及封闭CD47并激发抗肿瘤免疫的重组溶瘤腺病毒及其用途。
技术介绍
恶性肿瘤已成为严重威胁人类生命健康的一大类疾病，传统的抗肿瘤治疗手段包括手术治疗、化疗和放疗等，虽取得一些疗效，但因各自治疗的局限性始终无法达到预期的效果，研究表明癌症发病率及死亡率均呈明显上升趋势。近几年，随着对肿瘤发生发展机理研究的不断深入，包括基因治疗在内的生物治疗已经成为肿瘤临床中不可或缺的一部分。腺病毒因其致病性弱、基因携带能力强、与宿主细胞基因组整合风险低及基因组较易修饰并可大规模生产等优点，是基因治疗中最常用的病毒载体。据JGeneMed统计，截至2016年2月，全球共有2356项基因治疗进入临床试验，其中使用腺病毒作为载体的数量最多，达499项，占总数的21.2％。经过基因改造的溶瘤腺病毒能相对特异地在肿瘤细胞内复制增殖，裂解肿瘤细胞，而释放的子代病毒又可以感染周围肿瘤细胞，通过级联放大作用，高效杀伤肿瘤细胞，清除肿瘤病灶。在我国，溶瘤腺病毒药物H101联合化疗在多种类型恶性肿瘤的临床治疗或临床实验中显示了部分疗效(CurrentCancerDrugTargets，2007，7(2):141-8)。近年来，溶瘤腺病毒在增强免疫方面的功能逐渐被认知与重视(Viruses，2015，7(11):5780-91；NatRevDrugDiscov.，2015，14(9):642-62)。溶瘤腺病毒在裂解肿瘤细胞时，可促使肿瘤细胞免疫性死亡，包括免疫性细胞凋亡、坏死、自噬性细胞死亡等，上调钙网蛋白、热休克蛋白在细胞膜上的含量，释放ATP、高迁移率族蛋白B1(High-MobilityGroupBox1，HMGB1)、尿酸等损伤相关因子、病原相关分子、危险信号分子以及肿瘤相关抗原，从而进一步激活树突状细胞(DC)功能，提升抗肿瘤免疫反应(FrontOncol.，2014Apr10，4:74.)。研究证实，腺病毒可作为TLR9(Toll-LikeReceptor)的激动剂，促进DC细胞成熟，并增强I型IFN的免疫反应(JVirol.，2012，86(11):6279-85)。另外，腺病毒还被证明可诱导肿瘤细胞下调免疫相关信号通路，并通过增强IFNγ反应，诱导肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-AssociatedMacrophages，TAM)向M1型巨噬细胞转变，从而重塑肿瘤微环境，发挥治疗作用(Oncotarget，2016，7(2):1500-15)。CD47是一种细胞表面分子，是免疫球蛋白(Ig)超家族的一员。CD47的受体为信号调节蛋白α(SignalRegulataryProteinα，SIRPα)，SIRPα主要表达于巨噬细胞、DC和中性粒细胞等髓系细胞和神经细胞等。研究表明，CD47可以与巨噬细胞表面的SIRPα结合，作为“别吃我”信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用(JBiochem.，2014，155(6):335-44)。表达于正常细胞的CD47分子可作为“自我”的标志，保护自己避免被误吞噬；衰老细胞和损伤细胞因CD47缺失可被自体巨噬细胞有效吞噬并清除；而肿瘤细胞可通过CD47-SIRPα通路逃避巨噬细胞的吞噬作用，引起免疫逃逸。CD47最早被认为是一种肿瘤抗原，CD47被发现在多种肿瘤细胞及肿瘤干细胞表面异常高表达(JBiochem.，2014，155(6):335-44；Immunotherapy，2014，6(3):290-308；Hepatology，2014，60(1):179-91)，因此通过抗体阻断CD47-SIRPα通路，可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，是较为理想的实体瘤免疫治疗靶点。WeiskopfK等通过酵母细胞表面展示技术，将SIRPα负责结合CD47的区段进行点突变改造，使其与CD47的亲和力提高了约50000倍，达到pM数量级，能高效阻断CD47-SIRPα之间的结合，增强巨噬细胞的吞噬作用，与其它肿瘤抗体联用，还可增强抗体介导的吞噬效应(Science，2013，341(6141):88-91)。另有研究表明，CD47是机体固有免疫与获得性免疫的重要连接节点。通过阻断CD47信号，不仅可以通过巨噬细胞的交叉提呈作用，还可直接通过DC的抗原提呈作用，增强T细胞功能(ProcNatlAcadSciUSA，2013，110(27):11103-8；NatMed.，2015，21(10):1209-15)。另外，抗CD47抗体可通过Fc依赖性途径如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)杀伤肿瘤细胞(CurrOpinImmunol.，2012April，24(2):225–232)。并通过与一些细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等联合治疗增强抗肿瘤活性。应用CD47抗体阻断CD47-SIRPα通路，通过竞争性抑制作用解放巨噬细胞表面的SIRPα分子，释放巨噬细胞发挥免疫杀伤肿瘤细胞功能，已在多种类型恶性肿瘤(例如白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌或头颈部肿瘤等)中得到证实，可以参见Cell2010，142(5):699-713；CurrOpinImmunol.2012，24(2):225–232。因而，如能通过溶瘤病毒携带CD47抗体基因，通过溶瘤病毒对肿瘤细胞的裂解作用，释放肿瘤抗原，募集DC、T细胞、巨噬细胞，增强免疫功能；同时，高效表达CD47抗体，封闭肿瘤细胞的CD47表面分子，增强DC的抗原提呈能力与巨噬细胞的吞噬能力，协同发挥溶瘤病毒与CD47抗体的抗肿瘤活性。然而，作为一种自我保护机制，病毒在感染宿主细胞后，通常可诱使细胞上调CD47分子的表达，避免免疫细胞对感染病毒宿主细胞的攻击，使子代病毒能安全的在宿主细胞内完成复制增殖(JImmunol.2006，177(3):1817-24；Autoimmunity.2011，44(7):532-42.)。因而，一旦腺病毒表达CD47抗体，可能对病毒的增殖造成不利影响，影响溶瘤病毒发挥治疗作用，同时影响CD47抗体的表达。据此分析，平衡CD47抗体对溶瘤病毒免疫增强功能与病毒增殖活性的正负向作用，是携带CD47抗体基因的溶瘤病毒发挥抗癌功能的关键。
技术实现思路
本专利技术利用腺病毒平台携带可封闭CD47分子的SIRPα-Fc融合基因，该腺病毒E1A由人端粒酶逆转录酶启动子控制；E1B区19KDa与55KDa蛋白编码序列缺失，作为外源基因表达框的插入位点；E1A与外源基因表达框之间插入一段绝缘子序列，避免两个表达框的互相干扰。同时，为提高腺病毒对肿瘤细胞的感染效率，利用35型腺病毒的纤毛蛋白替换5型腺病毒，成功构建出携带SIRPα-Fc融合基因的重组腺病毒SG635-SF。本专利技术人惊奇的发现，本专利技术携带SIRPα-Fc融合蛋白基因的溶瘤腺病毒可在肿瘤细胞内特异性快速复制增殖，裂解肿瘤细胞；同时表达SIRPα-Fc融合蛋白，封闭肿瘤细胞表面CD47分子，增强巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬效应。同时，本专利技术病毒载体与表达元件的整体设计有效平衡了CD47抗体对溶瘤病毒免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：SIRPα‑Fc基因，即SIRPαCV1结合区与人IgG1Fc段基因的融合基因，或其简并序列；或SIRPα‑Fc基因通过连接序列与其他外源基因连接形成的多核苷酸序列或其简并序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：SIRPα-Fc基因，即SIRPαCV1结合区与人IgG1Fc段基因的融合基因，或其简并序列；或SIRPα-Fc基因通过连接序列与其他外源基因连接形成的多核苷酸序列或其简并序列。2.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒载体，其中，所述重组溶瘤腺病毒载体可操作地插入或者包含依次连接的下述外源基因：组成型强启动子、融合基因SIRPα-Fc或其简并序列、SV40PolyA和第一绝缘子序列。3.根据权利要求2所述的重组溶瘤腺病毒载体，其特征在于，所述重组溶瘤腺病毒载体具有如下的(1)－(14)中的任一项或者多项：(1)所述SIRPαCV1结合区的序列如SEQIDNO：4所示；(2)所述人IgG1Fc段基因的序列如SEQIDNO：5所示；(3)所述SIRPαCV1结合区序列和人IgG1Fc段基因经由编码接头序列的多核苷酸序列连接；优选地，所述接头序列含有一个或多个甘氨酸，优选为GGC；更优选地，所述SIRPα-Fc基因的序列如SEQIDNO：6所示；(4)所述组成型强启动子为CCAU、CMV、CAG、SV40、EF-1α、Ubc或PGK启动子；优选为CCAU或CMV启动子；优选地，所述CCAU启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；优选地，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；(7)所述第一绝缘子序列如SEQIDNO：1所示；(8)所述外源基因可操作地连接或插入在腺病毒E1B区；(9)所述腺病毒E1B区的19KDa与55KDa蛋白编码序列缺失；(10)所述腺病毒E1A的启动子为人端粒酶逆转录酶启动子、癌胚抗原启动子、甲胎蛋白启动子、前列腺素特异性抗原的启动子或缺氧诱导因子-1调控的缺氧反应元件启动子；优选为人端粒酶逆转录酶启动子；更优选地，所述人端粒酶逆转录酶启动子的序列如SEQIDNO：7所示；(11)所述腺病毒E1A表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，金华君，吕赛群，刘品一，黄耀，李林芳，丁娜，吴孟超，
申请(专利权)人：上海白泽生物科技有限公司，上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31