一种利用ANP或IgANP基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用ANP或IgANP基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用。本发明专利技术以ANP为目的基因构建重组腺病毒载体，该载体在舌癌细胞SCC9内表达ANP多肽，同时在ANP序列前添加一个免疫球蛋白的信号肽序列，构建分泌型ANP多肽。重组腺病毒感染舌癌细胞，通过RT‑PCR，证实了ANP或IgANP可以在舌癌细胞SCC9中表达，通过MTT细胞相对活性检测和细胞划痕实验，证实了ANP在体外实验中具有抑制舌癌细胞SCC9活性和迁移的作用，并且IgANP的作用效果更为明显，从而抑制舌癌细胞生长。本发明专利技术方法效率高、产量大，提供了一种未见报道的抗肿瘤细胞迁移和生长的基因治疗系统。

A recombinant adenovirus and recombinant adenovirus and its application by using ANP or IgANP gene

The present invention discloses a method for constructing recombinant adenovirus by using ANP or IgANP gene and the recombinant adenovirus and its application. The recombinant adenovirus vector is constructed with ANP as the target gene. The vector expresses ANP polypeptide in tongue cancer cell SCC9, and at the same time, a signal peptide sequence of immunoglobulin is added to ANP sequence to construct secretory ANP polypeptide. Recombinant adenovirus infection of tongue cancer cells by RT PCR,, confirmed that ANP or IgANP can be expressed in SCC9 cell, MTT cell through relative activity detection and cell scratch experiments confirmed that ANP can inhibit the activity and migration of squamous cell carcinoma SCC9 in vitro experiment, and the effect of IgANP is more obvious in order to inhibit the growth of tongue cancer cells. The method has high efficiency and high yield, and provides a gene therapy system that has not been reported for the migration and growth of antitumor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种利用ANP或IgANP基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用
本专利技术涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用ANP或IgANP基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和在制备抑制舌癌细胞活性的药物中的应用。
技术介绍
舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，98％以上为鳞状细胞癌，其生物学特性主要表现为局部浸润生长及颈部淋巴结转移。舌鳞癌患者颈部淋巴结转移率较高，易发生早期颈淋巴结转移，发生颈淋巴结转移者的预后较未发生颈淋巴结转移者明显变差，颈淋巴结转移是导致舌鳞癌患者死亡的重要因素之一。因此，如何抑制癌细胞转移，提高治疗预后性显得尤为重要。在过去几十年里人们癌症的研究和治疗已经取得了重大进展。然而，传统的癌症治疗效果不理想，大多数化疗药物对癌细胞有杀伤性但也对健康快速分裂的细胞有杀伤性，并且也会抑制免疫系统，同时也存在着癌症耐药性以及瘤区药物浓度不足等问题。这大大降低了他们的治疗效果，其原因与药物对癌症细胞特异性不足有关。由于需要不断寻找新的治疗药物，尤其是那些能够逃避耐药性、抑制转移和无其他重要的副作用的药物，抗癌肽已成为新的研究的目标之一。抗癌肽是一类小分子多肽类新型抗癌药物，通过破坏肿瘤细胞膜结构或抑制癌细胞增殖和迁移以及肿瘤血管的形成达到对癌细胞杀伤作用，而对正常细胞的毒性较低，是目前抗肿瘤新药研究的一大热点。心房利钠肽(ANP)是一种由28个氨基酸残基组成的多功能活性肽，亦称心房利钠因子、心房利尿肽、心钠素或心房肽。最早从大鼠以及人的心房组织中分离出一种具有利钠利尿的活性多肽物质——心房利尿肽，在临床上具有增加血管通透性、降压、利钠、利尿、舒张血管平滑肌及抑制细胞增殖等作用，在维持血压，水、钠平衡及在心血管疾病的病理生理过程中发挥的重要作用已得也到了广泛的认可。在最近的研究发现，它可以直接杀死肿瘤细胞或强力抑制癌细胞DNA的合成，从而抑制癌细胞的生长，而对正常的人体细胞不会产生毒性反应。现有的给药途径包括口服给药、呼吸道给药、经皮给药。胃肠道对蛋白质多肽类药物的低吸收及其中的酶对药物的降解是口服多肽类药物面临的两大障碍。因此，寻找合适的吸收位点，避免胃肠道的酶降解作用以及肝脏的首过效应是解决问题的关键。多肽药物在呼吸道给药的同时也面临着鼻粘膜中氨肽酶对多肽降解的威胁，鼻腔纤毛的清除作用也会影响多肽药物的吸收。经皮给药可以避免蛋白酶的直接降解和组织器官的清除作用，但是此方法必须克服皮肤角质层的屏障，为促进多肽药物进入皮肤，目前应用较多的是离子导入技术，但是该系统大多还处于实验室阶段，仍然存在一些问题，比如：通过皮肤的电流，因皮肤的生理条件而受强度和持续时间的限制；促渗机制的确定；透皮药物的选择；导入装置的更加实用、方便、经济等都需进一步研究。本专利技术根据抑制肿瘤细胞转移提高癌症治疗预后性的策略提供了一种新的、有临床应用前景的抑制肿瘤细胞转移的靶向药物。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，以ANP或分泌型ANP(IgANP)为目的基因构建重组腺病毒载体，用重组腺病毒载体作为舌癌基因治疗的系统，利用表达ANP或分泌型ANP的基因治疗方法可以起到抑制舌癌细胞活性和迁移的作用。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供以下技术方案：在第一方面，本专利技术提供一种利用ANP或分泌型ANP基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：1)proANP基因片段的获得：a、细胞总RNA的提取；b、cDNA的获得；c、proANP基因扩增：proANP基因扩增体系所用的引物如下：Sene：CGGGTACCCCATGAGCTCCTTCTCCACCACC；Antisene：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；重叠PCR引物1：CTTCCAAATGGTCCAGCAAATTCTTGAAATCCATCAGGTCTGCG；重叠PCR引物2：CGCAGACCTGATGGATTTCAAGAATTTGCTGGACCATTTGGAAG；2)ANP和IgANP基因片段的获得：a、利用PCR反应从proANP片段中获取ANP基因，所用引物如下：ANPsens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGAGCCTGCGGAGATCCAGC；ANPanti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；b、重叠PCR反应获得IgANP基因：首先，利用PCR反应合成可用于重叠PCR的Igκ信号肽基因，所用引物如下：Igκsens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGG；Igκanti序列：GCAGCTGGATCTCCGCAGGCTGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCC。以及，利用PCR反应从proANP片段中获取可用于重叠PCR的SecANP基因，所用引物如下：SecANPsens序列：AGCCTGCGGAGATCCAGC；ANPanti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；最后，以上述Igκ信号肽基因和ANP基因为模板，获得IgANP基因片段，所用引物为SecANPsens和Igκanti；3)pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP穿梭载体的构建：IgANP或ANP与pAdTrack-CMV载体连接；4)pAd-IgANP或pAd-ANP腺病毒骨架载体的构建：pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP质粒PmeI单酶切，取回收产物与pAd-easy质粒一起转化BJ5183感受态中，提取质粒即pAd-IgANP或pAd-ANP；5)制备重组腺病毒Ad-IgANP或Ad-ANP：将提取的pAd-IgANP或pAd-ANP质粒，使用PacI单酶切线性化后，使用Lipofectamine2000转染293-A细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因的表达，7天后可看到大量细胞漂浮,荧光开始减弱，此时先吸出一部分上清液转移到无菌的15mL的离心管中，剩余的培养基反复吹打皿底未漂浮的细胞，将其同培养基一起转移到离心管中；1000转，5min，离心收集上清液，即为包装后获得的重组腺病毒Ad-IgANP或Ad-ANP。本专利技术第二方面，提供由上述方法制备的重组腺病毒，其表达ANP或分泌型ANP，所述ANP的序列如SEQIDNO：1所示，分泌型ANP的序列如SEQIDNO：2所示。SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY(SEQIDNO：1)；METDTLLLWVLLLWVPGSTGDSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY(SEQIDNO：2)。由于密码子的简并性，本专利技术所述ANP基因的序列还可以包括任何能编码SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述分泌型ANP基因的序列还可以包括任何能编码SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，其携带的ANP基因的核苷酸序列为:AGCCTGCGGAGATCCAGCTGCTTCGGGGGCAGGATGGACAGGATTGGAGCCCAGAGCGGACTGGGCTGTAACAGCTTCCGGTACTGA(SEQIDNO：3)；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用ANP或分泌型ANP基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)proANP基因片段的获得：a、细胞总RNA的提取；b、cDNA的获得；c、proANP基因扩增：proANP基因扩增体系所用的引物如下：Sene：CGGGTACCCCATGAGCTCCTTCTCCACCACC；Antisene：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；重叠PCR引物1：CTTCCAAATGGTCCAGCAAATTCTTGAAATCCATCAGGTCTGCG；重叠PCR引物2：CGCAGACCTGATGGATTTCAAGAATTTGCTGGACCATTTGGAAG；2)ANP和IgANP基因片段的获得：a、利用PCR反应从proANP片段中获取ANP基因，所用引物如下：ANP sens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGAGCCTGCGGAGATCCAGC；ANP anti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；b、重叠PCR反应获得IgANP基因：首先，利用PCR反应合成可用于重叠PCR的Igκ信号肽基因，所用引物如下：Igκsens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGG；Igκanti序列：GCAGCTGGATCTCCGCAGGCTGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCC。以及，利用PCR反应从proANP片段中获取可用于重叠PCR的SecANP基因，所用引物如下：SecANP sens序列：AGCCTGCGGAGATCCAGC；ANP anti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；最后，以上述Igκ信号肽基因和ANP基因为模板，获得IgANP基因片段，所用引物为SecANP sens和Igκanti；3)pAdTrack‑IgANP或pAdTrack‑ANP穿梭载体的构建：IgANP或ANP与Track载体连接；4)pAd‑IgANP或pAd‑ANP腺病毒骨架载体的构建：pAdTrack‑IgANP或pAdTrack‑ANP质粒Pme I单酶切，取回收产物与pAd‑easy‑1质粒一起转化BJ5183感受态中，提取质粒即pAd‑IgANP或pAd‑ANP；5)制备重组腺病毒Ad‑IgANP或Ad‑ANP：将提取的pAd‑IgANP或pAd‑ANP质粒，使用Pac I单酶切线性化后，使用Lipofectamine2000转染293‑A细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因的表达，7天后可看到大量细胞漂浮,荧光开始减弱，此时先吸出一部分上清液转移到无菌的15mL的离心管中，剩余的培养基反复吹打皿底未漂浮的细胞，将其同培养基一起转移到离心管中；1000转，5min，离心收集上清液，即为包装后获得的重组腺病毒Ad‑IgANP或Ad‑ANP。...

【技术特征摘要】
1.一种利用ANP或分泌型ANP基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)proANP基因片段的获得：a、细胞总RNA的提取；b、cDNA的获得；c、proANP基因扩增：proANP基因扩增体系所用的引物如下：Sene：CGGGTACCCCATGAGCTCCTTCTCCACCACC；Antisene：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；重叠PCR引物1：CTTCCAAATGGTCCAGCAAATTCTTGAAATCCATCAGGTCTGCG；重叠PCR引物2：CGCAGACCTGATGGATTTCAAGAATTTGCTGGACCATTTGGAAG；2)ANP和IgANP基因片段的获得：a、利用PCR反应从proANP片段中获取ANP基因，所用引物如下：ANPsens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGAGCCTGCGGAGATCCAGC；ANPanti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；b、重叠PCR反应获得IgANP基因：首先，利用PCR反应合成可用于重叠PCR的Igκ信号肽基因，所用引物如下：Igκsens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGG；Igκanti序列：GCAGCTGGATCTCCGCAGGCTGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCC。以及，利用PCR反应从proANP片段中获取可用于重叠PCR的SecANP基因，所用引物如下：SecANPsens序列：AGCCTGCGGAGATCCAGC；ANPanti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；最后，以上述Igκ信号肽基因和ANP基因为模板，获得IgANP基因片段，所用引物为SecANPsens和Igκanti；3)pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP穿梭载体的构建：IgANP或ANP与Track载体连接；4)pAd-IgANP或pAd-ANP腺病毒骨架载体的构建：pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP质粒PmeI单酶切，取回收产物与p...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军林，岳硕豪，赵志扬，谢立兰，赖晓晶，程烨，李毅，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42