跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法。所述重组腺病毒是利用重组腺病毒质粒进行腺病毒包装而得到的，所述重组腺病毒质粒由上述跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体同源重组形成。重组腺病毒穿梭载体插入有目的基因片段包括Intron A、共表达分泌型CD40L、跨膜型PCV2 Cap和分泌型GMC SF以及WPRE。通过提高蛋白表达量，以及使CD40L、Cap和GMCSF可以共表达，CD40L和GMCSF分泌到细胞外，Cap镶嵌到细胞膜上，更好更快地被抗原呈递细胞识别。该重组腺病毒结合两种不同作用机制，可增强腺病毒载体疫苗免疫原性。

【技术实现步骤摘要】
跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法
本专利技术属于基因工程疫苗领域，具体涉及跨膜型猪圆环病毒2型(PCV2)重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的构建。
技术介绍
腺病毒具有致病力低、宿主范围广、稳定性好、易进行重组DNA操作、病毒滴度高、易于浓缩和贮存以及能容纳较大基因片段等优点，而且其生物学背景已研究得相当清楚，因而腺病毒载体在疫苗制备、癌症、传染病和遗传病的基因治疗等方面被广泛研究和应用，被认为是最有前途的载体之一。腺病毒作为一种常用的疫苗载体，其最大的问题是腺病毒自身蛋白可以诱导宿主产生强烈的免疫应答反应，从而限制了这种疫苗在临床实践中的应用。降低腺病毒自身免疫反应的方法之一是提高目的蛋白的表达量，从而降低腺病毒免疫剂量，进而降低腺病毒自身免疫反应。人巨细胞病毒第一内含子IntronA作为转录调节元件，与hCMV启动子/增强子一同提高缺失内含子的目的基因的表达。内含子可能通过几种不同机制来提高基因表达效率，这些机制通常分为两类：一类是保护机制；另一类是增强机制。保护机制强调内含子的保护能力，认为内含子的某些序列能够通过自身折叠或者结合其他蛋白形成一种二级结构从而达到稳定初级转录本的目的。另外内含子序列还可以作为RNA保护因子的靶序列来稳定初级转录本，间接增加了mRNA在核内的稳定性，导致细胞质中积累更多的成熟mRNA，进而增强目的基因的表达效率。增强机制则强调内含子的促转录能力。某些内含子有这样一些序列，能够起到类似增强子或其他顺式调控元件的功能，它们同某些蛋白质结合从而影响其转录的起始和延伸，开放染色体的功能域。另一个调控基因表达的元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件WPRE，主要作用是增加mRNA的稳定性、3'端的加工、促进mRNA出核以及胞质中mRNA的积累，从而增强未经剪接的目的基因表达量。另一个方法是增强腺病毒载体疫苗的免疫效果，常用方法是引入细胞因子作为分子佐剂以增强疫苗免疫效果。CD40L是肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)家族成员之一，CD40是其受体。CD40-CD40L交联不仅在体液免疫中扮演重要角色，而且在调节细胞介导的免疫应答中也发挥重要的作用。一方面CD40-CD40L交联对B细胞的活化、增殖，抗体的产生以及Ig类别转换，起了非常重要的作用。另一方面CD40-CD40L交联可促进CD4+T细胞自身被活化，表达CD25、CD40L增高，促进IL-12的跨膜，而后者参与CTL的产生以及诱导T细胞向Thl细胞分化。另一个细胞因子是GMCSF，其不仅能刺激造血祖细胞增殖、分化和成熟，而且还能活化中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dendriticcells,DC)及其他单核细胞，在细胞因子网络中占有重要地位。GMCSF能够诱导造血前体细胞分化增殖，维持造血前体细胞和成熟血细胞的存活，增强DC的活性和生物学功能，促进皮肤中朗罕氏细胞的增殖分化，吸引DC向注射部位集聚和成熟，并提高其抗原递呈能力，从而起到增强疫苗免疫效果的作用。猪圆环病毒相关性疾病(porcinecircovirusassociateddisease，PCVAD)是猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)引起的流行非常广泛的猪传染性疾病。1991年加拿大首次暴发该病，随后许多国家报道了该病，PCVAD已经给养猪业造成巨大经济损失。PCV2重组腺病毒载体疫苗已经有人进行过相关研究，例如未修饰的PCV2重组腺病毒载体疫苗Ad-Cap，但是还没有相应的商品化PCV2重组腺病毒载体疫苗应用于临床实践。分析原因得出：腺病毒载体自身蛋白可以诱导机体产生强烈的免疫应答反应，严重影响机体针对目的蛋白免疫应答反应。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，该重组腺病毒穿梭载体为插入有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒，所述目的基因片段包括蛋白编码区以及增强表达元件，所述增强表达元件包括人巨细胞病毒第一内含子IntronA以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，所述蛋白编码区包括带有分泌信号肽sp的肿瘤坏死因子相关激活蛋白CD40L(分泌型CD40L)序列、带有跨膜信号肽tp的猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap(跨膜型PCV2Cap)序列以及带有分泌信号肽sp的粒细胞-巨细胞集落刺激因子GMCSF(分泌型GMCSF)序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF为共表达。所述蛋白编码区还包括设置在所述CD40L、Cap以及GMCSF序列两两之间的自剪切2A肽的序列。所述重组腺病毒穿梭载体具体包括依次排列的启动子、目的基因片段、polyA尾以及左、右两个同源臂序列。上述跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体的构建方法，包括以下步骤：1)构建目的基因片段1.1)将所述CD40L序列、所述Cap序列、所述GMCSF序列三个片段，利用重叠PCR进行连接，得到中间片段，且其中任意两个片段之间插入有自剪切2A肽的序列；1.2)将所述中间片段与IntronA及WPRE连接，得到目的基因片段；2)将目的基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒。所述步骤1.1)具体包括以下步骤：1.1.1)以pS-CD40L-Cap-GMCSF质粒为扩增模板，通过引物P1和P2、P3和P4及P7和P8分别扩增得到包含有所述CD40L序列的sp-CD40L-2A-tp片段、包含有所述Cap序列的tp-Cap-2A-sp片段及包含有所述GMCSF序列的sp-GMCSF片段；P1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，P2的序列如SEQ.ID.NO.2所示，P3的序列如SEQ.ID.NO.3所示，P4的序列如SEQ.ID.NO.4所示，P7的序列如SEQ.ID.NO.7所示，P8的序列如SEQ.ID.NO.8所示；1.1.2)将sp-CD40L-2A-tp片段及tp-Cap-2A-sp片段通过引物P5和P6进行重叠PCR，得到sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段，然后将sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段及sp-GMCSF片段通过引物P5和P8进行重叠PCR，得到中间片段sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF；P5的序列如SEQ.ID.NO.5所示，P6的序列如SEQ.ID.NO.6所示。所述步骤1.2)具体包括以下步骤：将puc-IntronA-Cap-WPRE质粒中的Cap序列用所述中间片段(例如，sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF)替换，得到扩增模板，然后通过引物P9和P10扩增得到目的基因片段；P9的序列如SEQ.ID.NO.9所示，P10的序列如SEQ.ID.NO.10所示。所述步骤2)的具体包括以下步骤：将目的基因片段插入至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV的多克隆位点。一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒，所述重组腺病毒是利用重组腺病毒质粒进行腺病毒包装而得到的，所述重组腺病毒质粒由上述跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体同源重组形成。所述重组腺病毒质粒的序列如S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，其特征在于：该重组腺病毒穿梭载体为插入有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒，所述目的基因片段包括蛋白编码区以及增强表达元件，所述增强表达元件包括人巨细胞病毒第一内含子Intron A以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，所述蛋白编码区包括带有分泌信号肽sp的肿瘤坏死因子相关激活蛋白CD40L序列、带有跨膜信号肽tp的猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap序列以及带有分泌信号肽sp的粒细胞‑巨细胞集落刺激因子GMCSF序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF为共表达。

【技术特征摘要】
1.一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，其特征在于：该重组腺病毒穿梭载体为插入有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒，所述目的基因片段包括蛋白编码区以及增强表达元件，所述增强表达元件包括人巨细胞病毒第一内含子IntronA以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，所述蛋白编码区包括带有分泌信号肽sp的肿瘤坏死因子相关激活蛋白CD40L序列、带有跨膜信号肽tp的猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap序列以及带有分泌信号肽sp的粒细胞-巨细胞集落刺激因子GMCSF序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF为共表达。2.根据权利要求1所述一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，其特征在于：所述蛋白编码区还包括设置在所述CD40L、Cap以及GMCSF序列两两之间的自剪切2A肽的序列。3.根据权利要求1所述一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，其特征在于：所述重组腺病毒穿梭载体具体包括依次排列的启动子、目的基因片段、polyA尾以及两个同源臂序列。4.一种如权利要求1所述的跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建目的基因片段1.1)将所述CD40L序列、所述Cap序列、所述GMCSF序列三个片段，利用重叠PCR进行连接，得到中间片段，且其中任意两个片段之间插入有自剪切2A肽的序列；1.2)将所述中间片段与IntronA及WPRE连接，得到目的基因片段；2)将目的基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1.1)具体包括以下步骤：1.1.1)以pS-CD40L-Cap-GMCSF质粒为扩增模板，通过引物P1和P2、P3和P4及P7和P8分别扩增得到包含有所述CD40L序列的sp-CD40L-2A-tp片段、包含有所述Cap序列的tp-Cap-2A-sp片段及包含有所述GMCSF序列的sp-GMCSF片段；P1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，P2的序列如SEQ.ID.NO.2所示，P3的序列如SEQ.ID.NO.3所示，P4的序列如SEQ.ID.NO.4所示，P7的序列如SEQ.ID.NO.7所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：童德文，黄勇，李德龙，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61