编码双特异性抗体的溶瘤腺病毒及与其相关的方法和用途技术

本发明专利技术涉及生命科学和医学领域。具体地，本发明专利技术涉及人的癌症疗法。更具体地，本发明专利技术涉及编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒载体。此外，本发明专利技术涉及利用溶瘤腺病毒载体以及连同过继细胞疗法的方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码双特异性抗体的溶瘤腺病毒及与其相关的方法和用途专利
本专利技术涉及生命科学和医学领域。具体地，本专利技术涉及人的癌症治疗。更具体地，本专利技术涉及编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒(oncolyticadenoviral)载体。此外，本专利技术涉及利用溶瘤腺病毒载体以及连同过继细胞疗法的方法和用途。专利技术背景不断开发用于癌症治疗的新疗法。过继细胞疗法(adoptivecelltherapy)(ACT)是用于治疗癌症，而且也用于治疗其它疾病如感染和移植物抗宿主病(graftversushostdisease)的有效方法。过继细胞转移(Adoptivecelltransfer)是将离体生长的细胞(最常见的是免疫来源的细胞)被动地移植到宿主中，目的是转移移植物的免疫学功能和特征。过继细胞转移可以是自体的，如在过继性T细胞疗法中常见的，或是同种异体的(allogeneic)，如对于治疗感染或移植物抗宿主病典型的。临床上，该方法的常见实施方案包括将免疫促进细胞或致耐受性细胞诸如淋巴细胞转移到患者以增加针对病毒和癌症的免疫力，或在自身免疫疾病诸如I型糖尿病或类风湿性关节炎背景中促进耐受性。已经使用自体肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte)(TIL)或遗传上重新定向的外周血单核细胞的过继转移来成功治疗具有黑色素瘤(melanoma)的患者以及表达CD19的血液恶性肿瘤的患者。在ACT中，最常用的细胞类型为T细胞，有时针对CD8+分选，但其它变化包括CD4+细胞，NK细胞，delta-gammaT细胞，调节性T细胞和外周血单核细胞。细胞可以是未经修饰的，例如在TIL疗法中或经遗传修饰的。在TIL疗法中，使用未分选的多克隆细胞。有两种常见的方法来实现T细胞对肿瘤特异性靶标的遗传靶向。一种是转移具有已知特异性(TCR疗法)并且具有匹配的人白细胞抗原(HLA，被称为啮齿动物中的主要组织相容性复合体)类型的T细胞受体。另一种是用人工分子如嵌合抗原受体(CAR)修饰细胞。这种方法不依赖于HLA，并且在靶向细胞表面分子方面更灵活。例如，可以使用单链抗体，并且CAR也可以掺入共刺激结构域。然而，CAR细胞的靶标需要在靶细胞的膜上，而TCR修饰可以利用细胞内靶标。在TCR和CAR疗法中，从患者的外周血获得T细胞。尽管过继细胞疗法的发展，过继性T细胞疗法在占超过90％的人类癌症和95％的癌症死亡率的非黑色素瘤实体瘤上的临床结果是令人失望的。其主要原因是肿瘤微环境是高度免疫抑制的，其使T细胞移植物失活并变得无能力(anergize)，抑制移植物的局部增殖，并阻止过继转移的T细胞向肿瘤的运输。目前没有有效的解决此问题的工具。T细胞衔接剂(T-cellengager)已用于癌症治疗。主要类别是三功能抗体，用化学方法连接的Fab和双特异性T细胞衔接剂(BiTE)，后者是临床上最先进的(BaeuerlePA,ReinhardtC.CancerRes.2009Jun15；69(12):4941-4)。虽然已经在临床前研究了几个BiTE，并且已经有两个(blinatumomab，一种抗CD19BiTE，和solitomab，抗EpCAMBite)存在于临床试验中，但是出现了许多问题。一个主要问题是中靶脱瘤毒性(on-target-off-tumortoxicity)，这导致高的不利事件率，包括在blinatumomab临床试验中12％的毒性死亡率(ToppMSetal.2011,JClinOncol.Jun20；29(18):2493-8)。另一个问题是BiTE在靶标(肿瘤)中的浓度不足，这尤其在实体瘤的背景下是存在问题的，所述实体瘤的肿块形成了对BiTE渗透和集中的障碍。这可能解释了为什么在solitomab的试验中没有看到正式的响应(肿瘤大小的减少，其满足RECIST标准)。最好的响应是暂时稳定疾病，这在38％的患者中达到(WalterMetal.2012,JClinOncol30,(suppl；abstr2504))。BiTE的另一个问题是在人类中的半衰期短，需要连续输注，这不是常规使用的实用解决方案。已经提出了将装甲有(armedwith)T细胞衔接剂的溶瘤病毒载体用于癌症治疗。WO2014138314A1(PCT/US2014/020935)和Yuetal.(2014,MolTher22(1):102-11)描述了编码抗EphA2BiTe的溶瘤牛痘病毒。关于BiTE的载体递送(vectoreddelivery)，包括双重单链构建体诸如BiTE的单链分子不能从哺乳动物细胞自动分泌。事实上，单链分子和构建体诸如BiTE的较差的分泌已经在其基因治疗应用中形成了障碍。抗体通常由B细胞谱系浆细胞产生，并由此不意外的是，其从上皮肿瘤细胞产生和释放是存在问题的。在单独或与其它疗法一起的溶瘤病毒载体的功效方面，仍有改进的空间。通常保证疗法的增加的特异性和充分的治疗肿瘤杀伤能力。本专利技术通过利用特定的病毒载体，例如，与过继细胞疗法一起来提供用于癌症治疗剂的有效工具和方法。专利技术概述本专利技术的目的是提供用于克服低效，不安全和不可预测的癌症疗法的以上问题的简单方法和工具。在一个实施方案中，本专利技术提供用于细胞治疗的新的方法和手段。本专利技术的目的通过特定的病毒载体，方法和排列(arrangement)实现，这些通过独立权利要求中的陈述来表征。在从属权利要求中公开了本专利技术的具体实施方案。本专利技术提出使用特定的溶瘤腺病毒来解决高度免疫抑制性肿瘤微环境的问题，所述肿瘤微环境使T细胞移植物失活且变得无能力，抑制移植物的局部增殖，并阻止过继转移的T细胞向肿瘤的运输。本专利技术基于令人惊奇的见解：即编码双特异性T细胞衔接剂(BiTE)的溶瘤腺病毒可以解决所述问题(图1)。特别地，与本专利技术相关的数据指示，腺病毒可以诱导小鼠的肿瘤和人中的危险信号，如通过干扰素gamma产生例示(图2)，这导致TIM3(TIM3是肿瘤免疫抑制的关键指标)表达的减少(图3)。重要的是，即使单独的腺病毒能够在肿瘤中产生危险信号，这不足以将T细胞募集到肿瘤中(图4)。因此，为了过继细胞疗法的最佳增强，需要用BiTE装甲溶瘤腺病毒(图1)值得注意的是，我们有显示TIM3表达以及溶瘤性腺病毒下调TIM3的能力与患者存活相关的人类数据。这是有力的数据，指示由腺病毒引起的危险信号传递导致肿瘤免疫抑制的下调，其与患者的临床益处相关(图10)。重要的是，不是所有的溶瘤病毒都是一样的，并且事实上牛痘病毒不能在肿瘤中产生危险信号，并因此与通过局部产生BiTE用于肿瘤免疫治疗的腺病毒不相容(图5-6)。本专利技术解决了BiTE全身毒性和局部功效差以及半衰期短的问题，即是通过腺病毒载体在肿瘤局部产生BiTE，该特征特别是在实体瘤的背景下是有利的(图9)。此外，本专利技术以令人惊讶的方式解决了单链BiTE分子分泌较差的问题：当使用仅在肿瘤细胞中复制的溶瘤腺病毒，并且复制的最后步骤是细胞裂解时，BiTE释放到肿瘤微环境中(图8)。换句话说，本专利技术以令人惊讶的方式解决了BiTE的分泌问题，通过利用溶瘤(oncolysis)作为释放装置。根据本专利技术，不需要BiTE的分泌，并且实际上是作为另外的方法不优选将BiTE本文档来自技高网...

【技术保护点】
溶瘤腺病毒(oncolytic adenoviral)载体，其包含在E3区域中的核酸序列的缺失，和编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，替换E3区域中缺失的核酸序列，其中所述双特异性单克隆抗体包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.17 FI 201551821.溶瘤腺病毒(oncolyticadenoviral)载体，其包含在E3区域中的核酸序列的缺失，和编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，替换E3区域中缺失的核酸序列，其中所述双特异性单克隆抗体包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv。2.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述腺病毒载体的主链是腺病毒血清型5(Ad5)或腺病毒血清型3(Ad3)核酸主链。3.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体还包含用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子。4.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体还包含在腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)。5.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中E3区域中的核酸序列的缺失是病毒gp19k和6.7k阅读框(readingframe)的缺失。6.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体包含：1)用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子2)腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)；3)病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失；和4)编码两分型分子(bipartitemolecule)的核酸序列，替换如在3)点中定义的缺失的核酸序列，所述两分型分子包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv。7.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述主链是Ad5核酸主链，并且所述载体还包含Ad3纤维结(fiberknob)。8.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述细胞表面分子在免疫效应细胞上。9.根据权利要求8所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述效应细胞是T淋巴细胞。10.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述肿瘤抗原选自表1或由间皮素(mesothelin)、EpCAM1和MUC1组成的组。11.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述细胞表面分子选自CD3、CD8和CD4。12.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述肿瘤抗原是间皮素并且所述细胞表面分子是CD3；所述肿瘤抗原为EpCAM1并且所述细胞表面分子是CD3；或所述肿瘤抗原是MUC1并且所述细胞表面分子是CD3。13.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述溶瘤腺病毒载体编码两个或更多个转基因。14.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其还包含IL-2、TNFalpha或CD40L转基因。15.药物组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的溶瘤腺病毒载体。16.根据权利要求1-14中任一项的溶瘤腺病毒载体，其用于治疗癌症。17.根据权利要求16中使用的溶瘤腺病毒载体，其与过继细胞治疗组合物(adoptivecelltherapeuticcomposition)一起使用。18.治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括将权利要求1-14中任一项的溶瘤腺病毒载体施用于受试者。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用过继细胞治疗组合物。20.根据权利要求17或19所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述过继细胞治疗组合物包含选自下组的细胞类型：肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte)(TIL)、T细胞受体修饰的淋巴细胞(T-cellreceptormodifiedlymphocyte)和嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞(chimericantigenreceptormodifiedlymphocyte)。21.根据权利要求17或19-20中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述过继细胞治疗组合物包含选自下组的细胞类型：T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、delta-gammaT细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞。22.根据权利要求17或19-21中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述过继细胞治疗组合物包含T细胞。23.根据权利要求16-22中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述癌症选自下组：鼻咽癌(nasopharyngealcancer)、滑膜癌(synovialcancer)、肝细胞癌(hepatocellularcancer)、肾癌(renalcancer)、结缔组织癌(cancerofconnectivetissues)、黑色素瘤(melanoma)、肺癌(lungcancer)、肠癌(bowelcancer)、结肠癌(coloncancer)、直肠癌(rectalcancer)、结直肠癌(colorectalcancer)、脑癌(braincancer)、喉癌(throatcancer)、口腔癌(oralcancer)、肝癌(livercancer)、骨癌(bonecancer)、胰腺癌(pancreaticcancer)、绒毛膜癌(chorioca...

【专利技术属性】
技术研发人员：A赫明基，S帕尔维艾宁，S泰蒂宁，I利卡宁，M休雷拉，
申请(专利权)人：倾斜生物医疗公司，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI