一种新型双纤维蛋白腺病毒载体及用途制造技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的新型腺病毒载体及其构建方法和应用。具体涉及到一种具有全新结构特征，不影响包装、对人体正常细胞无毒害作用、并且对肿瘤细胞有杀伤力的新型腺病毒载体和溶瘤腺病毒的设计构建及其应用。

【技术实现步骤摘要】
一种新型双纤维蛋白腺病毒载体及用途

技术介绍
重组腺病毒(recombinantadenovirus)由于具有转基因效率高、安全性好、外源基因容量大等优点，目前已广泛应用于基因治疗和疫苗载体的研究。截止到2014年2月，根据Wiley出版集团的最新统计，在世界范围内总计1996例基因治疗临床试验方案中(http://www.wiley.com//legacy/wileychi/genmed/clinical/)，以腺病毒为载体的有478例，占总数的23.4％，高居首位。但是随着应用腺病毒载体的临床研究不断深入，目前也存在一些限制其人体临床应用的问题如预存免疫、肝脏富集、靶向表达不足等尚待解决。为解决腺病毒载体临床应用中存在的问题，通过对衣壳蛋白进行基因修饰实现结构改造的研究很多。目前对腺病毒载体进行结构改造的目的和策略主要包括：(1)纤维蛋白(fiber)修饰调控感染嗜向性实现靶向基因传递。决定腺病毒感染嗜性的主要结构是识别细胞受体的纤维蛋白knob结构域，因此这一类的修饰策略主要通过改变纤维蛋白或knob的结构实现靶向等目的。如以Ad35的knob替换Ad5构建嵌合型的Ad5F35可以感染一些CAR缺失的细胞等[11]。然而，总结以往对于纤维蛋白的结构修饰，我们发现这类改造大多会不同程度的降低病毒的感染能力，进而影响腺病毒载体的转基因效率。(2)结构蛋白整合抗原表位增强疫苗免疫原性。利用分子生物学技术将重要病毒或细菌的B细胞表位或T细胞表位整合到腺病毒的衣壳蛋白表面，借助腺病毒载体自身的强免疫原性提升机体针对外源表位的免疫反应，从而增强腺病毒载体疫苗的保护力[2]。(3)六邻体(hexon)嵌合修饰逃避机体预存免疫。无论是作为疫苗载体还是基因治疗载体，目前应用最多的腺病毒载体是人血清5型腺病毒(Ad5)。然而，Ad5的一个主要问题是人体针对载体本身存在十分普遍的预存免疫，即人体内较高的针对Ad5的中和抗体水平会显著地降低腺病毒载体的转导效率和转基因表达水平。另外，临床研究发现当机体存在中和抗体时注射腺病毒载体疫苗甚至可能引发意外的安全风险。最新的流行病学研究表明：我国及欧美国家Ad5中和抗体的血清阳性率为60-80％[3]，而非洲撒哈拉和东南亚的部分地区高于90％[4]。因此，解决预存免疫问题对于腺病毒载体的人体临床应用至关重要。对Ad5载体进行基因工程改造构建六邻体嵌合型腺病毒载体是十分理想的一种策略，然而对六邻体的基因修饰往往会导致病毒难以包装和扩增[5]。因此，目前在该领域仍然需要通过设计新策略，利用基因工程技术进一步对腺病毒进行改造，以获得更为理想的基因治疗载体。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosis–inducingligand，TRAIL)是1995年发现的肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)家族新成员[6]。TRAIL通过死亡受体途径能特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性，因此自被发现以来很快便成为研究热点。基于对腺病毒结构的了解通过结构分析我们发现，可溶性TRAIL与腺病毒纤维蛋白fiber的knob结构域具有较大的结构相似性。而我们利用腺病毒fiber的shaft片层修饰可溶性TRAIL获得了稳定性和活性更好的重组TRAIL蛋白[7]。另外，我们之前的研究还表明特异性结合于腺病毒衣壳表面的TRAIL能够明显提升腺病毒载体的肿瘤靶向性[8]。因此，以TRAIL替换Ad5的knob构建fiber嵌合型腺病毒载体的策略在结构和功能上是可行的。然而，这种类似Ad5F35的嵌合型病毒由于缺乏识别受体的结构，必然导致感染力的缺失或下降。基于我们对腺病毒的了解，在所有已发现的57个血清型人腺病毒中，Ad40和Ad41分别具有长两种fiber(数目各半)，其中长fiber的发挥识别受体的功能，而短fiber的功能目前仍未明确[9]。有研究以Ad40或Ad41的短fiber(knob)替换Ad5相应结构以分析其功能，结果发现这种构建明显降低了Ad5的感染性[10]。可能由于病毒包装的原因，目前尚没有构建具有两种fiber的Ad5载体的报道。另外，有文献报道禽1型腺病毒(FAV1)也具有长短两种fiber但其数目相同，结构研究显示病毒衣壳上每个五邻体基底伸展出长度不同的两个fiber[11]。经过序列比对，我们发现这种禽腺病毒的两个fiber的序列是连续的，且第一个fiber(即长fiber)与Ad5的fiber具有一定的同源性。综上，我们全新设计是构建一种具有两个纤维蛋白(Dual-fiber)的新型腺病毒载体，该载体在保留Ad5原始fiber的同时，再伸展出一个包含TRAIL的嵌合型fiber(例如以TRAIL替换FAV1短fiber的knob)。该载体有望在不降低Ad5感染性的同时增强对肿瘤细胞的靶向性和并产生凋亡活性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新型的衣壳蛋白基因修饰型腺病毒载体，其特点是病毒的衣壳表面具有两种形式的纤维蛋白。该载体是通过模拟禽类腺病毒结构利用基因工程技术对人5型腺病毒的纤维蛋白的C末端进行基因修饰，使产生的新型腺病毒载体衣壳表面具有天然纤维蛋白结构的同时再伸展出一个嵌合形式的纤维蛋白，该嵌合形式的纤维蛋白是利用TRAIL基因替换knob基因表达产生的。本专利技术提供的新型双纤维蛋白腺病毒载体，其衣壳结构上具有的天然纤维蛋白有助于保持腺病毒载体感染多种细胞的能力，而新产生的嵌合形式纤维蛋白则赋予新型腺病毒载体更好的肿瘤靶向性和抗肿瘤活性。本专利技术提供的新型双纤维蛋白腺病毒载体还进一步构建了双纤维蛋白溶瘤腺病毒载体，该溶瘤腺病毒载体的抗肿瘤活性优于复制缺陷型腺病毒载体和未改造的溶瘤腺病毒。附图说明图1.新型双纤维蛋白腺病毒载体结构示意图。图2.新型腺病毒载体骨架质粒构建示意图。图3.新型腺病毒载体基因组PCR鉴定电泳图。图4.SlotBlot鉴定新型腺病毒载体。图5.免疫电镜鉴定新型腺病毒载体。图6.新型腺病毒载体细胞杀伤能力检测。图7.新型溶瘤腺病毒载体细胞杀伤能力检测。具体实施方式实施例1新型腺病毒载体骨架质粒构建1、PCR获得TRAIL基因利用RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取外周血PBMC的总mRNA后，参照说明书配制RT-PCR体系，再通过反转录获得cDNA。以cDNA为模板，PCR获得TRAIL基因。TRAIL引物如下(吉林省库美生物科技有限公司)：senseprimer：5’-ATGGCTATGATGGAGGTCC-3’antisenseprimer：5’-GCTCTAGATTTTTCTTTCCAGGTCAGTTAG-3’TCTAGA为插入的XbaI酶切位点PCR的反应体系(50ul)：灭菌水：34.5ul10×buffer：5ulMgSO4(25mM):2uldNTP(2mM)：5ul引物混合物：各0.5ul(20mM)模板(cDNA)：1ul高保真Taq酶(1units/ul)：1ulPCR反应程序(30个循环)：预变性：94℃，3min；变性：94℃，30s；退火：54℃，30s；延伸：72℃，2min；再延伸：72℃，10min。2、骨架质粒构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型双纤维蛋白腺病毒载体，其特征在于腺病毒衣壳表面具有两种形式的纤维蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种新型双纤维蛋白腺病毒载体，其特征在于腺病毒衣壳表面具有两种形式的纤维蛋白。2.权利要求1所述的新型双纤维蛋白腺病毒载体，其中所述的腺病毒衍生自人腺病毒、禽腺病毒和猴、马、牛、羊、猪、狗、鼠等哺乳类动物腺病毒。3.权利要求2所述的新型双纤维蛋白腺病毒载体，其中所述腺病毒进一步衍生自人血清5型腺病毒。4.权利要求1所述的新型双纤维蛋白腺病毒载体，是通过模拟禽类腺病毒结构利用基因工程技术对人血清5型腺病毒的纤维蛋白的C末端进行基因修饰，进而在产生天然纤维蛋白的同时再伸展出一个嵌合形式的纤维蛋白。5.权利要求4所述的新型双纤维蛋白腺病毒载体，其中所述嵌合形式纤维蛋白来自于人腺病毒、禽腺病毒和猴、马、牛、羊、猪、狗、鼠等哺乳类动物腺病毒。6.权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：于彬，于湘晖，孔维，王宝明，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22