HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用技术

本发明专利技术公开了一种HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，从NDV F48E9株和ILTV WG株中分别扩增出HN基因和gD基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pDC315‑MCS‑EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315‑HN‑gD‑EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得含有HN基因和gD基因的重组腺病毒pBH‑HN‑gD‑EGFP；本发明专利技术用于免疫禽以预防禽新城疫和传染性喉气管炎，将此重组腺病毒免疫鸡后，鸡的抗体水平得到显著提高。

Construction of recombinant adenovirus of HN gene and gD gene and recombinant adenovirus and its application

The invention discloses a construction method and application of recombinant adenovirus and a recombinant adenovirus HN gene and gD gene from NDV, F48E9 and ILTV strains WG strain were amplified by HN gene and gD gene, the target gene was cloned into the shuttle vector pDC315 MCS EGFP, using liposome transfection the Recombinant Adenovirus Shuttle Plasmid pDC315 HN gD EGFP with adenovirus backbone pBHGlox (delta) E1,3Cre were transfected into HEK293 cells, and the recombinant package containing HN gene and gD gene recombinant adenovirus pBH HN gD EGFP; the invention is used for immunization to prevent avian Newcastle disease and avian infectious tracheitis, the recombinant adenovirus Immunized Chicken, chicken antibody level has been improved.

【技术实现步骤摘要】
HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用
本专利技术属于基因生物工程领域，涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。
技术介绍
新城疫(Newcastledisease，ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的一种发病率和死亡率高的急性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须法定报告的疫病，并且对发生疫情的国家和地区实行限制和贸易禁运。鸡传染性喉气管炎(Infectiouslaryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectiouslaryngotracheitisvirus,ILTV)引起的鸡的一种急性呼吸道传染病，属于B类传染病。该病在世界范围内流行传播，可引起禽类发病，特别是鸡，常给养鸡业造成巨大经济损失。目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，但是它们存在着免疫持续时间短且可能会诱导潜伏感染等弊端。基因工程苗安全有效，克服了弱毒苗和灭活苗的不足；此外，二联苗还可以减少对动物免疫接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，将NDV的主要保护性抗原(HN基因)和ILTV的糖蛋白(gD基因)与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒，分别检测免疫鸡后机体内产生的两种抗体水平，评价研制的预防NDV和ILTV的二联基因工程活载体疫苗。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：1)从NDVF48E9株和ILTVWG株中分别扩增出HN基因和gD基因；2)将获得的目的基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-HN-gD-EGFP；3)将重组穿梭载体pDC315-HN-gD-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP。具体地说，所述步骤1)为从NDVF48E9株和ILTVWG株中分别扩增出HN基因序列GI:EF211815.1和gD基因序列GI:JN969091.1；所述的HN基因和gD基因的扩增包括：以HN-FSEQIDNO.1和HN-RSEQIDNO.2为引物，以NDV的总RNA为模板，RT-PCR扩增获得HN基因；以gD-FSEQIDNO.3和gD-RSEQIDNO.4为引物，以ILTV的DNA为模板，PCR扩增获得gD基因；上述的HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。上述的HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在制备预防禽新城疫和传染性喉气管炎的生物制品中的应用。本专利技术的有益效果是：分别将NDV的HN基因和ILTVgD基因与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP，籍此研制同时预防ND和ILT两种传染病的二联基因工程活载体疫苗。通过对免疫鸡的两种抗体水平检测，评价了重组腺病毒的免疫效果。研究结果表明，重组腺病毒可以刺激机体产生抗体，免疫重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP的雏鸡，35日龄后两种抗体均可达到有效抗体水平(OD405＞1.4)，显著优于对照组pBH-EGFP(OD405＝0.2)，与市场弱毒苗的免疫保护作用差异不显著。本专利技术研制出一种预防ND和ILT的二联基因工程活载体疫苗。附图说明图1是HN基因和gD基因RT-PCR/PCR扩增结果图(M:DL2502bpDNA分子质量标准；1:HN基因RT-PCR产物；2:gD基因PCR产物)。图2是PMD-HN和PMD-gD质粒的PCR扩增结果图(M:DL2502bpDNA分子质量标准；1:PMD-HN质粒PCR产物；2:PMD-gD质粒PCR产物)。图3是pDC315-HN-EGFP和、pDC315-gD-EGFP和pDC315-HN-gD-EGFP质粒的PCR扩增结果图[M:DL2502bpDNA分子质量标准；1:pDC315-gD-EGFP质粒PCR产物；2:pDC315-HN-EGFP质粒PCR产物；3:pDC315-HN-gD-EGFP质粒PCR产物(HN基因上游引物，gD基因下游引物)；4:pDC315-HN-gD-EGFP质粒PCR产物(HN基因和gD基因上下游引物)]。图4是重组穿梭载体pDC315-HN-gD-EGFP质粒双酶切结果图(M.DL2502DNA分子质量标准；1.pDC315-HN-gD-EGFP经EcoRI和NheI的双酶切产物；2.pDC315-HN-gD-EGFP经SalI和XmaI的双酶切产物)图5是重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP感染HEK293细胞图(20×)(A.正常HEK293细胞图；B.荧光显微镜下正常HEK293细胞图；C.重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP感染HEK293细胞图；D.重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP感染HEK293细胞荧光图)。图6是重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP的RT-PCR鉴定图(1：重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP的HN基因的RT-PCR扩增产物；2：重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP的gD基因的RT-PCR扩增产物；3：重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP的HN基因和gD基因的RT-PCR扩增产物)。图7是Western-blotting检测HN蛋白和gD蛋白在HEK293细胞中的表达图。图8是ELISA检测鸡分别免疫NDV弱毒疫苗(Lasota株)及重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP疫苗后的抗体水平情况图。图9是ELISA检测鸡分别免疫ILTV弱毒疫苗K317株及重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP疫苗后的抗体水平情况图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：新城疫(ND)和鸡传染性喉气管炎(ILT)是严重危害养鸡业的急性传染病。目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们在一定程度上可以预防和控制上述疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程苗同时具备弱毒苗和灭活苗的优势，又能克服二者不足；此外，二联苗还可以减少对动物免疫接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。目前腺病毒载体系统已经相当成熟，相比其他载体具有明显的优势，国内外均有很多以腺病毒为载体制备疫苗的报道。对NDV和ILTV的研究也已相当清晰，有报道利用其它活载体研制ND或ILT的基因工程疫苗，且免疫攻毒试验证实对鸡有一定的保护作用，因此，本专利技术利用新城疫的HN基因和鸡传染性喉气管炎的gD基因构建重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP，籍此研制预防禽ND和ILT两种传染病的二联基因工程活载体疫苗。本专利技术HN基因和gD基因构建重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP的方法，包括以下步骤：1)NDVHN和ILTVgD基因片段的扩增与T-A克隆；2)构建重组穿梭载体pDC315-HN-gD-EGFP；3)在HEK293细胞中重组和包装病毒pBH-HN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从NDV F48E9株和ILTV WG株中分别扩增出HN基因和gD基因；2)将获得的目的基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315‑MCS‑EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315‑HN‑gD‑EGFP；3)将重组穿梭载体pDC315‑HN‑gD‑EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox E1,3Cre共转染H EK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH‑HN‑gD‑EGFP。

【技术特征摘要】
1.一种HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从NDVF48E9株和ILTVWG株中分别扩增出HN基因和gD基因；2)将获得的目的基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-HN-gD-EGFP；3)将重组穿梭载体pDC315-HN-gD-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP。2.根据权利要求1所述HN基因和gD基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤1)为从NDVF48E9株和ILTVW...

【专利技术属性】
技术研发人员：金天明，高珂珂，张东超，李小慧，赵瑞利，林静，李昕，孟佳丽，尚翠玲，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津,12