本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种与PD-1和VEGF高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途。具体地，本发明专利技术涉及一种分离的融合蛋白，其包含如下肽段：（1）人类PD-L2的胞外区肽段；（2）人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段；以及任选的（3）人类免疫球蛋白的Fc段。本发明专利技术的融合蛋白能够抑制肿瘤细胞生长，促进其死亡，抑制T细胞失活，增强杀瘤能力。
【技术实现步骤摘要】
与PD-1和VEGF高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种与ro-1和VEGF高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途。
技术介绍
单克隆抗体靶标明确，临床应用安全性好、疗效明显，目前共有10个肿瘤单克隆抗体经美国FDA批准上市销售，已成为多种类型恶性肿瘤治疗的一线药物。然而一方面，全长抗体分子量大，不易进入实体瘤组织，难以在肿瘤内部达到有效治疗浓度，从而发挥抗肿瘤疗效。另一方面，肿瘤发病机制复杂，细胞内信号通路冗余或交叉，单一靶标的治疗疗效不足且易形成耐药性。而应用多个针对不同靶标的单抗进行联合治疗，疗效虽优于单一靶标治疗，但费用非常昂贵，患者难以承担。因而，非常必要研制分子量小、多靶点的抗体类蛋白药物。程序性死亡分子I (programmed death-1 receptor, PD-1)是T细胞天然免疫抑制分子，肿瘤细胞可通过过量表达其细胞表面I3D-1的配体(PD-L1/PD-L2)，作用于T细胞表面ro-1，激活ro-1通路，诱导τ细胞凋亡，形成免疫逃逸及耐受。因而，PD-1已成为肿瘤治疗的重要靶标。一项ro-Ι抗体(BMS-936558或MDX-1106)的I期临床试验(296例患者)表明，PD-1抗体能使四分之一至五分之一的非小细胞肺癌患者，黑色素瘤患者，或肾细胞癌患者产生客观反应(J Clin Oncol.2010;28:3167-75 ;N Engl J Med.2012; 366:2443-54)，显示其具有良好的临床应用价值。VEGF有促进血管生成的作用，肿瘤细胞可大量分泌VEGF，作用于其受体VEGFRl(Vascular endothelial growth factor receptor I,也称作 FLT-1)及 VEGFR2(Vascularendothelial growth factor receptor 2,也称作KDR),诱导肿瘤组织新生血管的生成，使肿瘤体积快速扩张(Nat Med.1999;5:1359-64);此外，VEGF可以抑制DC的分化与成熟，抑制机体的抗肿瘤T细胞免疫应答而逃避免疫监视(Blood.2003;101:4878-86)。目前，针对VEGF的单抗Bevacizumab (Avastin)已经由美国FDA批准上市销售,广泛应用于结肠癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、肾癌、神经胶质瘤的治疗，2010年销售额达64.6亿美元。有意思的是，Flt-1或KDR的胞外区多肽也可在体外阻断VEGF信号通路，抑制血管内皮细胞的生长(Cancer Res.2002; 9:633-40)。通过基因工程技术，将Flt-1与KDR胞外区段中的某些特定免疫球蛋白样(Ig样)结构域(如Flt-1的第2Ig样结构域Fltl-D2，KDR的第3Ig样结构域KDR-D3)融合，可有效阻断细胞VEGF信号通路(Proc Natl Acad SciUSA.2002;99:11393-8 ；Gene Ther.2009;16:10-6)。因而，如能同时阻断肿瘤细胞VEGF及T细胞Η)-1通路，有望有效抑制肿瘤生长，消除免疫耐受，发挥抗肿瘤作用。
技术实现思路
本专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种融合蛋白，本专利技术人惊奇地发现，其能够与PD-1、VEGF高效结合，同时阻断肿瘤细胞VEGF及T细胞TO-1通路，具有显著的抗肿瘤作用，有应用于制备防治恶性肿瘤的药物或基因治疗药物的潜力。由此提供了下述专利技术:本专利技术的一个方面涉及一种分离的融合蛋白，其包含如下肽段:I)人类PD-L2的胞外区肽段；2)人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段；以及任选的3)人类免疫球蛋白的Fe段。不拘于理论的限制，人类ro-L2的胞外区肽段能够高效地结合ro-1。不拘于理论的限制，天然状态下，PD-1与TOL1/PDL2均是膜蛋白，其结合涉及肿瘤细胞与免疫细胞的应答，对T细胞起抑制作用。而本专利技术设计的融合蛋白是游离状态的，与抗体的作用机制类似。虽其也能通过ro-L2的胞外区与ro-1结合，但所起的作用是与肿瘤细胞表面的TOL1/PDL2竞争性的结合T细胞表面的ro-Ι，封闭T细胞天然免疫分子I3D-1的作用，阻止T细胞的凋亡。不拘于理论的限 制，VEGF受体FLT-1的胞外区第2个免疫球蛋白样结构域(简称为Fltl-D2)的肽段和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域(简称为KDR-D3)的肽段均能够高效结合VEGF。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，所述人类ro-L2的胞外区肽段包含或者为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，所述人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，所述人类KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，相对于(I)和(2)中所述的肽段，所述Fe段位于融合蛋白的靠近C末端的一侧。在本专利技术的一个实施方案中，从融合蛋白的N末端至C末端的连接顺序依次为(I)中所述的多肽、(2)中所述的多肽以及(3)中所述的Fe段。在本专利技术的一个实施方案中，从融合蛋白的N末端至C末端的连接顺序依次为(2 )中所述的多肽、(I)中所述的多肽以及(3)中所述的Fe段。在本专利技术中，所述的人类免疫球蛋白的Fe段，不仅包括天然的Fe段序列，还包括对其进行人工修饰、改造或突变的并且具有Fe段功能的序列。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，所述Fe段选自人类免疫球蛋白IgG各亚型(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM或者IgA的全长Fe段；优选地，所述的Fe段不具有ADCC效应；优选地，所述Fe段为IgG4的全长Fe段。不拘于理论的限制，本专利技术的靶标之一是T细胞上的ro-1，只要求阻断T细胞的ro-Ι通路，防止其凋亡，不能选用具有ADCC效应的IgG Fe。不然，当融合蛋白与T细胞结合后，机体会通过ADCC效应对T细胞进行清除，而IgG4 Fe无ADCC效应，所以是优选的。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，人类TO-L2的胞外区肽段为一个或多个拷贝；具体地，为两个拷贝。不拘于理论的限制，多拷贝可以增强对靶标的亲和力，但如果拷贝数太多，可能本领域对融合蛋白空间构象的正确折叠，从而影响其功能；具体地，为2个拷贝。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段为一个或多个拷贝；具体地，为两个拷贝。根据本专利技术任一项所述的融合蛋白，其中，当为多个拷贝时，人类PD-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段为同源串联重复或间隔串联重复。根据本专利技术任一项所述融合蛋白，其还包含信号肽；优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。不拘于理论的限制，信号肽可以提高融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的融合蛋白，其包含如下肽段：1）人类PD‑L2的胞外区肽段；2）人类FLT‑1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段；以及任选的3）人类免疫球蛋白的Fc段。
【技术特征摘要】
1.一种分离的融合蛋白，其包含如下肽段: 1)人类ro-L2的胞外区肽段； 2)人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段；以及任选的 3)人类免疫球蛋白的Fe段。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于如下的(I)一(10)中的任一项或者多项: (1)所述人类TO-L2的胞外区肽段包含或者为SEQID NO:1所示的氨基酸序列； (2)所述人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQID NO:3所示的氨基酸序列； (3)所述人类KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQID NO:5所示的氨基酸序列； (4)所述人类免疫球蛋白Fe段选自人类免疫球蛋白IgG各亚型(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM或者IgA的全长Fe段；优选地，Fe段为IgG4的全长Fe段； (5)相对于I)和2)中所述的肽段，所述Fe段位于融合蛋白的靠近C末端的一侧； (6)所述人类TO-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段分别独立地为一个或多个拷贝；具体地，为两个拷贝； (7)当为多个拷贝时，所述人类TO-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段为同源串联重复或间隔串联重复； (8)所述融合蛋白还包含信号肽；优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:9所示； (9)所述人类TO-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段和/或KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段、人类免疫球蛋白的...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，金华君，王倩，丁娜，严巧灵，刘辉，俞德超，李林芳，吴孟超，
申请(专利权)人：上海白泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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