促神经元轴突再生的高表达TSP‑1干细胞制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及神经康复组织工程技术领域。具体而言，本发明专利技术公开了一种TSP‑1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：一、构建携带TSP‑1的腺病毒载体：用双酶切法制备pHBAd‑MCMV‑GFP载体和TSP‑1目的片段，将目的基因与载体pHBAd‑MCMV‑GFP连接，用测序法鉴定pHBAd‑MCMV‑GFP‑TSP‑1，保证了外源基因序列的正确性；二、TSP‑1腺病毒转染BMSCs，获得TSP‑1基因修饰骨髓间充质干细胞。本发明专利技术选择了TSP‑1基因修饰的骨髓间充质干细胞，加快移植后的神经康复组织工程神经元的恢复和突起的再生，加快损伤局部神经元回路的重建。

To promote axonal regeneration in the high expression of TSP 1 stem cell preparation and Application

The invention relates to the technical field of neural rehabilitation tissue engineering. Specifically, the invention discloses a preparation method of mesenchymal stem cells of a TSP 1 gene modified bone marrow, which comprises the following steps: first, construct the adenovirus vector carrying TSP 1: preparation of pHBAd MCMV GFP vector and TSP 1 fragment by double enzyme digestion, the target gene connected with the vector pHBAd MCMV GFP sequencing to identify the pHBAd MCMV GFP TSP 1, to ensure the correctness of the exogenous genes; two, TSP 1 adenovirus transfected BMSCs, TSP 1 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells. The invention selects TSP 1 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells, accelerate the regeneration of nerve tissue engineering rehabilitation after transplantation and recovery of neuronal processes, accelerate the reconstruction of local neuronal circuit.

【技术实现步骤摘要】
促神经元轴突再生的高表达TSP-1干细胞制备和应用
本专利技术涉及神经康复组织工程
，尤其涉及用于治疗脊髓损伤的促进轴突再生的高表达TSP-1干细胞制备和应用。
技术介绍
随着我国经济的不断发展，由于交通意外、高处坠落等原因导致的急性脊髓损伤(Spinalcordinjury，SCI)患者正逐年上升，如我国天津近年来统计其发生率为23.7人/100万，平均年龄：46.0±14.2岁，呈进行性增加趋势。脊髓损伤多见于青壮年，并且常导致患者感觉、运动、反射与括约肌功能障碍，特别是颈髓损伤，甚至遗留永久性的残疾，大多数患者需要长期住院治疗和康复，给家庭和社会带来了沉重的负担。因此，脊髓损伤后的功能保护和康复已成为目前世界各国研究的热点和难点。国内外研究表明，损伤局部突触丧失、轴突再生抑制是脊髓损伤后功能恢复的一个难题和治疗靶点。脊髓受外力打击时，脊髓损伤的主要病理变化包括上下行传导束中断、损伤节段突触丧失、残存轴突脱髓鞘。其中传导束损伤，神经回路中断是造成功能损伤的主要原因。目前已知影响脊髓损伤后的功能修复的因素有：(1)损伤局部神经营养因子缺乏。(2)存在髓鞘的轴突再生抑制物(包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
TSP‑1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下的步骤：一、构建携带TSP‑1的腺病毒载体：1)、用双酶切法制备pHBAd‑MCMV‑GFP载体和TSP‑1目的片段；2)、将目的基因与载体pHBAd‑MCMV‑GFP在16℃连接，得pHBAd‑MCMV‑GFP‑TSP‑1；3)、用测序法鉴定pHBAd‑MCMV‑GFP‑TSP‑1，保证了外源基因序列的正确性；所述测序法为：将pHBAd‑MCMV‑GFP‑TSP‑1测序结果与NCBI中TSP‑1基因比对，检测有无核苷酸的突变、缺失或者移位；选用与NCBI中序列完全相同的克隆子；二、TSP‑1腺病毒转染BMSCs：取大鼠骨髓间充...

【技术特征摘要】
1.TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下的步骤：一、构建携带TSP-1的腺病毒载体：1)、用双酶切法制备pHBAd-MCMV-GFP载体和TSP-1目的片段；2)、将目的基因与载体pHBAd-MCMV-GFP在16℃连接，得pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1；3)、用测序法鉴定pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1，保证了外源基因序列的正确性；所述测序法为：将pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1测序结果与NCBI中TSP-1基因比对，检测有无核苷酸的突变、缺失或者移位；选用与NCBI中序列完全相同的克隆子；二、TSP-1腺病毒转染BMSCs：取大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，细胞以1×106/孔密度接种于10cm培养皿中培养，24h细胞贴壁稳定后，准备进行转染；所述转染为：将pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1用3ml高糖无血清培基稀释，以MOI为50计算所需病毒液的量为5μL，再加入5μL浓度为2mg/ml的Polybrene，振荡混匀后，加入移除培养基的培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱内孵育6h；孵育结束后，吸除病毒液和无血清培养基，加入含血清的完全细胞培养液10ml继续培养48h，获得TSP-1基因修饰骨髓间充质干细胞。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓明，王琳琳，蒲玉洁，孟珂，林莉雅，林和风，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33