基于M2e表位的广谱型流感疫苗制造技术

本发明专利技术涉及基于M2e表位的广谱型流感疫苗，在重组腺病毒表面展示来自于H1N1，H5N1和H7N2三种不同流感亚型的M2e表位。本发明专利技术建立的重组腺病毒疫苗能在动物体内诱导M2e特异的免疫反应。在不加佐剂的情况下，本发明专利技术建立的重组腺病毒疫苗可完全保护动物抗击同源的H1N1攻击感染，对异源的H9N2和H5N1感染也有良好的保护效果。

Broad-spectrum influenza vaccine based on M2e epitopes

The present invention relates to a broad-spectrum influenza vaccine based on M2e epitope. It displays surface M2e epitopes of three different influenza subtypes from H1N1, H5N1 and H7N2 on the surface of recombinant adenovirus. The recombinant adenovirus vaccine established by the invention can induce the specific immune response of M2e in animals. Without adjuvant, the recombinant adenovirus vaccine established by the invention can completely protect the animals against homologous H1N1 attack infection, and has good protective effects on heterologous H9N2 and H5N1 infection.

【技术实现步骤摘要】
基于M2e表位的广谱型流感疫苗
本专利技术属于免疫学和病毒学领域，更具体地，本专利技术涉及基于M2e表位的广谱型流感疫苗。
技术介绍
流感病毒(IV)是一种持续进化的呼吸道致病原，时常引起流行，严重威胁生命安全，并对医疗卫生造成巨大的负担。流感病毒可以在不同宿主间传播，并引起季节性爆发。预防流感最有效的手段是接种疫苗。目前最广泛使用的三价裂解苗(TIV)是基于对即将到来的流感季节中流行株进行预测后设计。2009年，新型甲型流感病毒H1N1席卷了世界，其抗原与当时流行的季节性流感的HA有较大差异。研究表明，当季流感疫苗诱导的抗体对2009年H1N1几乎没有交叉反应。在2014-2015年，在美国流行的80％以上的H3N2与疫苗株抗原不匹配。据估计，针对H3N2疫苗的有效性大约只有18％，然而抗原匹配的B型流感病毒疫苗有效性可达到45％。此外，不断出现的禽流感病毒感染人的病例给流感疫苗研发带来了更大的挑战。研发广谱流感疫苗的一个基本策略就是寻找保守的表位作为免疫原。流感病毒基质蛋白2的胞外段(M2e)高度保守，其中十七个氨基酸在不同亚型间同源性达94％，使其成为理想的通用流感疫苗候选抗原之一。M2e在流感病毒表面形成四聚体，并充当离子通道。但由于M2e蛋白分子量小、病毒表面含量少、加上其他表面蛋白(如HA)的遮蔽作用，导致了其免疫原性较弱。在自然感染中，人体几乎不产生特异针对M2e的抗体。因此，开发以M2e为基础的广谱流感疫苗的主要难点在于如何提高其免疫原性。以往的研究中，采用了诸如化学或生物偶联的方法来增强M2e的免疫原性，部分M2e偶联物可完全或部分的保护小鼠抗击流感感染。然而，这些M2e疫苗需要辅以尚处于试验阶段的佐剂来提高免疫原性，例如弗氏完全佐剂和单磷酰脂质A等，而这些佐剂往往有着严重的副作用，并不适用于临床应用。因此，本领域亟待开发免疫原性提高的以M2e为基础的广谱流感疫苗，特别是无需佐剂的、无需鸡胚扩增的通用流感疫苗，以满足临床所需。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于重组腺病毒纤突蛋白展示流感病毒M2e表位的流感疫苗。在本专利技术的第一方面，提供一种重组腺病毒质粒，所述的重组腺病毒质粒是表达融合的流感病毒M2e表位的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体；其中，所述融合的流感病毒M2e表位包括：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。在一个优选例中，所述的重组腺病毒质粒中，所述的H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位之间以连接序列连接。在另一优选例中，所述的连接序列的氨基酸序列为：GlyAlaAla。在另一优选例中，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失。在另一优选例中，E1的大部份编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-CeuI和PI-SceI。在另一优选例中，述的质粒中，融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入在复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HIloop区域。在另一优选例中，所述的融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入到复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HIloop区域中两个PmeI之间的位置。在另一优选例中，所述融合的流感病毒M2e表位，按照N端→C端的顺序，依次为：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。在另一优选例中，该重组腺病毒质粒具有SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供所述的重组腺病毒质粒的用途，用于制备重组腺病毒，所述的重组腺病毒用于诱导M2e特异性免疫反应，或用于制备防治流感病毒感染的疫苗组合物。在一个优选例中，所述的流感病毒包括但不限于：H1N1亚型流感病毒、H5N1亚型流感病毒、H7N2亚型流感病毒、PR8流感病毒、H5N1亚型流感病毒、H9N2亚型流感病毒。在本专利技术的另一方面，提供一种重组腺病毒，述重组腺病毒由所述的重组腺病毒质粒包装获得。在本专利技术的另一方面，提供一种制备所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括：(1)制备所述的重组腺病毒质粒；(2)将(1)的重组腺病毒质粒转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。在一个优选例中，所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地包括：HEK293细胞，293T细胞。在本专利技术的另一方面，提供所述的重组腺病毒的用途，用于诱导M2e特异性免疫反应；或用于制备防治流感病毒感染的重组腺病毒疫苗组合物。在本专利技术的另一方面，提供一种重组腺病毒疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括：有效量的所述的重组腺病毒；以及药学上可接受的载体。在本专利技术的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有所述的重组腺病毒疫苗组合物。在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备重组腺病毒疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括：所述的重组腺病毒质粒；较佳地，其中还包括病毒生产细胞。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、纤突蛋白呈递M2e的重组黑猩猩腺病毒载体构建。A：本专利技术中展示的M2e来源及氨基酸序列；B：AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)的克隆示意图。图2、WesternBlot检测整合M2e的纤突蛋白三聚化。分别在非还原(A)和还原(B)条件下对纯化的重组腺病毒AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)进行WesternBlot检测。1010vp的AdC68-empty经同样处理后作为阴性对照。MW，分子量标准；泳道1，1010vp的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)；泳道2，109vp的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)；泳道3，1010vp的AdC68-empty。图3、WesternBlot检测重组腺病毒体外表达M2e。以1010vp/孔、109vp/孔、108vp/孔的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)感染HEK293细胞，24小时后收样品进行WesternBlot检测，以β-actin作为内参。1010vpAdC68-empty感染的细胞作为阴性对照。图4、ELISA检测纤突蛋白展示的M2e亲和性。以5*109vp/孔的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)或AdC68-empty包板，以半比梯度稀释的14C2为一抗，HRP标记的抗鼠IgG为二抗检测。所有结果表示为平均吸光值±标准方差(SD)，是三次独立重复实验中的一次结果。图5、AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)在BALB/C小鼠上引起的M2e特异的抗体反应。BALB/C小鼠加强免疫后2周采集血清，通过ELISA测定M2e特异的抗体反应。包被抗原量为50ng/孔，血清稀释度为1：100，分别测定血清中的总IgG(a)、IgG2a(b)和IgG1(c)。统计分析采用One-wayANOVA，所有结果表示为平均吸光值±标准方差(SD)，是三次独立重复实验中的一次结果。图6、BALB/C小鼠模型上检测AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)免疫后对H1N1、H5N1、H9N2流感攻击感染的保护效果。BALB/C小鼠(PR8实验n＝9，其他实验n＝10)两次肌肉免疫2.5*1010v本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒质粒，其特征在于，所述的重组腺病毒质粒是表达融合的流感病毒M2e表位的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体；其中，所述融合的流感病毒M2e表位包括：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒质粒，其特征在于，所述的重组腺病毒质粒是表达融合的流感病毒M2e表位的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体；其中，所述融合的流感病毒M2e表位包括：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。2.如权利要求1所述的重组腺病毒质粒，其特征在于，所述的H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位之间以连接序列连接。3.如权利要求1所述的重组腺病毒质粒，其特征在于，所述的连接序列的氨基酸序列为：GlyAlaAla。4.如权利要求3所述的重组腺病毒质粒，其特征在于，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失。5.如权利要求3或4所述的重组腺病毒质粒，其特征在于，所述的质粒中，融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入在复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HIloop区域。6.如权利要求1所述的重组腺病毒质粒，其特征在于，所述融合的流感病毒M2e表位，按照N端→C端的顺序，依次为：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。7.如权利要求1所述的重组腺病毒质粒，其特征在于，该重组腺病毒质粒具有SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：周东明，唐昕莹，杨勇，夏晓丽，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31